circRNA在眼部新生血管性疾病的研究进展

马 严 姚牧笛 蒋 沁 曹国凡

circRNA是信使RNA(message RNA，mRNA)反向剪接而成的闭合环状非编码RNA，其异常表达与多种疾病的发生、发展密切相关，包括肿瘤、心血管疾病、神经退行性疾病等[1]。在非编码RNA领域，circRNA成为继miRNA和长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)之后的又一研究热点。眼部新生血管性疾病主要是指眼部异常血管生成从而导致严重视力障碍的一类疾病，是中老年人不可逆视力丧失的重要原因，其核心过程是病理性血管新生，涉及血管内皮细胞(endothelial cells, ECs)的选择性出芽、增殖和周细胞的募集及管腔重建等。根据异常新生血管生长的解剖部位，眼部新生血管可分为角膜新生血管、视网膜新生血管和脉络膜新生血管等[2]。近年来研究发现circRNA在眼部新生血管性疾病的发病机制和调控中起着重要作用。

一、circRNA概述

1.circRNA的来源和形成：circRNA是一类在真核细胞中含量丰富且保守的内源性非编码RNA，由前体RNA(pre-mRNA)经反向首尾剪接或者基因重排形成，通过5′和3′端共价连接，形成没有PolyA尾巴的闭合环状RNA，不易被核酸外切酶降解，可在组织或体液中稳定存在[3]。早期人们对circRNA的功能知之甚少，被认为是线性RNA的副产品[4]。近年来，随着基因测序等相关技术的发展，circRNA的重要生物学功能逐渐被挖掘。circRNA 的来源主要有：①来源于外显子的circRNA(exon circRNA, ecircRNA)；②来源于外显子-内含子circRNA(exon-intron circRNA, EIciRNA)；③来源于内含子的circRNA(circular intronic RNA, ciRNA)；④来源于tRNA的circRNA(tricRNA)[4，5]。

circRNA形成模式主要有：①内含子配对介导的环化(又叫直接反剪接)；②套索机制驱动的环化(又叫外显子跳跃)；③套索内含子的直接环化；④RNA结合蛋白(RNA-binding protein, RBP)驱动的环化；⑤tRNA剪接过程环化[4，5]。目前，真核细胞中circRNA主要来自外显子，外显子circRNA的形成主要包括两种机制：第1种机制是直接反剪接，由于环化外显子两侧的内含子序列互补配对，pre-mRNA下游 5′剪接供体位点直接与上游 3′剪接受体位点接合形成circRNA，从而产生循环转录本；第2种机制是外显子跳跃，当前体mRNA 进行经典的 GU/AG 剪接时，外显子跳跃产生一个包含外显子和内含子的套索中间体，随后经过反向剪接，套索中的内含子被移除，形成ecircRNA[4]。除了上述的形成方式，目前还存在其他circRNA形成机制：①内含子套索驱动环化：由前体RNA在经典套索驱动环化形成的，内含子套索中的 5′剪接位点的重复7nt GU基因序列和分支位点的丰富11nt C-rich基因序列转录形成套索内含子并共价连接环化，形成 ciRNA[6]；②RBP驱动的环化：RBP通过互补序列与侧翼内含子序列相互作用，使两个侧翼内含子相互靠近，进而促进环化，并通过反向剪接使其头尾连接，形成 ecirc RNA 或 EIciRNA[4]；③tRNA剪接过程环化：通过识别前tRNA中的凸起-螺旋-凸起基序并切割，从而产生tRNA和tricRNA[5]。

2.circRNA的功能：竞争内源性RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)假说[7]：指信使 RNA(mRNA)、lnc RNA、假基因转录物等含有与miRNA反应元件(microRNA response element, MRE)相同的结合位点，可以竞争miRNA结合位点，降低miRNA对靶基因的抑制作用，从而上调miRNA目标基因表达，调节细胞内稳态，该过程又叫miRNA的“海绵作用”。目前研究最为透彻的两个是CDR1as/CIRS-7和Sry基因。CIRS-7/CDR1as在脑组织中高度表达，含有70多个选择性miR-7靶位点，并与miR-7结合，抑制miR-7活性来增加miR-7靶基因的水平，在斑马鱼中，miR-7的敲除或CIRS-7/CDR1as的表达损害了中脑的发育。睾丸组织中的circRNA性别决定区域circRNA-Sry，也具有可以与miR-138相互作用的结合位点，参与功能活动的调控[3]。这两项研究是circRNA的首次功能及机制研究，使circRNA成为RNA领域的一颗新星。目前，还有很多circRNA被证明具有miRNA分子海绵的作用。

circRNA还可与RBP相互作用，通过作为竞争位点来阻断蛋白质效应,在转录和转录后水平上控制基因表达[4]。例如circ-Foxo3主要在细胞质中表达，能够与衰老相关蛋白 ID1(inhibitor of DNA binding 1)、转录因子E2F1和低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1 subunit α, HIF-1α)结合，并抑制蛋白进入细胞核中，阻断其抗衰老功能，促进心肌细胞衰老。此外，circ-Foxo3还可以通过结合细胞分裂蛋白激酶 2(cell division protein kinase 2, CDK2)和P21蛋白形成circ-Foxo3-p21-CDK2三元复合物来抑制细胞周期进程，进而结束细胞进程导致细胞凋亡[8]。circRNA还具有编码蛋白质和多肽的功能，一种方式是通过内部核糖体进入位点IRES(internal ribosome entry sites)序列促进起始因子或核糖体与可翻译circRNA直接结合，如circZNF609[9]等。此外，circRNA 在缺乏 IRES、polyA和 5′帽结构的条件下，也可以通过RCA(rolling circle amplification)机制翻译蛋白质[10]。研究还发现大量的circRNA 富含m6A甲基化修饰，驱动circRNA从而启动翻译[11]。

circRNA 存在于体液及血液中，占总RNA的1%，含量相对丰富。与lncRNA和miRNA比较，circRNA因其特殊环状结构具有独特的抗RNA酶降解能力，更容易获得和检测。不同类型的细胞中circRNA差异性表达，因此具有组织特异性[12]。circRNA丰度高，稳定性好，特异性高。原则上，可以在人类全血、血浆、唾液和外泌体中检测到circRNA，作为特定的生物学标志物。

二、CircRNA与眼部新生血管性疾病

1.角膜新生血管：主要是由病原体感染或物理、化学损伤及内源性调节因子的异常表达引起，导致角膜缘血管在角膜中异常生长，使角膜失去正常透明度，严重可导致失明[13]。Zhou等[14]对NaOH碱烧伤诱导的角膜新生血管小鼠模型进行circRNA微阵列分析，鉴定出174个上调55个下调共229个差异表达的circRNA，cKifap3和cZNF609的异常表达与角膜新生血管的发生、发展密切相关，其中cKifap3通过ceRNA机制作为miR-184的分子海绵，作用于Akt、VEGF通路调节角膜新生血管的形成。Wu等[15]进一步利用角膜缝线诱导的角膜新生血管大鼠模型阐述cZNF609在角膜新生血管形成中进一步的作用和机制。研究提示，cZNF609作为miR-184海绵隔离miR-184活性，提高下游Akt和VEGF表达水平，促进人角膜上皮角质形成细胞的体外增殖、迁移和成管。干预cZNF609的表达可能为角膜新血管性疾病开创新的治疗理念。

2.糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)：糖尿病严重的微血管并发症，是视网膜血管疾病的代表性疾病，位居中老年致盲性眼病第1位。高血糖引起视网膜ECs失衡，血-视网膜屏障功能受损，血管通透性增加，DR可导致微血管功能障碍和神经胶质变性为表现的神经-血管单元病变，晚期可出现新生血管和增殖膜等[2]。目前临床治疗方法主要针对晚期视力严重受损的患者，需反复多次注射或手术，组织创伤大[16]。因此，进一步寻找相关诊断标志物和治疗靶标对眼部新生血管性疾病的早期防治具有重要的战略性意义。

circHIPK3是由HIPK3基因的2号外显子产生，在肺、视网膜、胃肠道、卵巢等不同的组织中均有所表达，参与多种癌症的发病机制[17]。Shan等[18]研究发现，circHIPK3在链脲佐菌素诱导的DR小鼠模型和高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞(human retinal vascular endothelial cells, HRVECs)中表达显著上调。沉默circHIPK3抑制HRVECs活力、增殖、迁移和成管等能力，减少视网膜无细胞毛细血管、血管渗漏、炎症和水肿，保护视网膜功能。circHIPK3作为内源性miR-30a-3p分子海绵，通过ceRNA机制导致下游VEGF-C、FZD4和WNT2表达增加，调控血管内皮病变。此外，临床上对DR患者的房水标本检测发现，circHIPK3表达明显上调。上述研究提示，circHIPK3可通过多种调控通路调节内皮细胞功能，circHIPK3/miR-30a-3p/VEGF-C、FZD4、WNT2轴可能在DR的发生、发展中起重要作用，为认知DR病因和发病机制提供了全新的分子信息，为糖尿病微血管病变研究提供了新的机制和视角。

Liu等[19]研究发现，在高糖和低氧应激下cZNF609表达显著上调，敲低cZNF609可以减少视网膜血管丢失和病理性血管新生，荧光素酶报告基因测定证实cZNF609可能与miR615-5p相互作用，cZNF609可能通过cZNF609/miR615-5p/MEF-2A网络调节DR血管功能，参与眼部新生血管性疾病的发生，并可能作为其潜在治疗靶标。circHIPK3和cZNF609的研究激起了血管领域对非编码RNA研究的热情，为非编码RNA在血管领域的研究做出了重要突破，同时也促进了不同学科的交叉。Zhang等[20]通过微阵列分析了DR患者血浆、玻璃体纤维血管中circRNA表达情况，检测出356个上调和173个下调的circRNA，提示糖尿病微血管病变可能与多个circRNA的异常表达相关。其中，circ-0005015可作为内源性miR-519d-3p海绵，抑制miR-519d-3p活性，促进MMP-2、STAT3及XIAP蛋白的表达，调节ECs功能，促进血管生成。Zhu等[21]研究发现CircDNMT3B通过调节miR-20b-5p, 靶向作用于BAMBI参与调控内皮稳定和维持血管动态平衡。CircDNMT3B的高表达可调节ECs功能，减少糖尿病视网膜渗漏和视功能损伤，逆转视网膜电图a、b波振幅下降。circCOL1A2作为miR-29b海绵，提高VEGF，MMP-2，MMP-9表达水平，沉默circCOL1A2可能减少血管新生，减少高糖刺激下的视网膜结构和功能损害。以上研究表明，circRNA可通过多个致病途径介导DR中新生血管的发展，有望成为DR的潜在诊断、预后生物学标志物及抗新生血管治疗靶标。

周细胞是血管成熟和视网膜屏障的重要组成部分，周细胞丢失是DR的早期病理特征，异常的周细胞-内皮细胞串扰可导致视网膜血管渗漏、闭塞和成熟障碍。有研究发现，在临床标本及STZ诱导的DR小鼠视网膜组织中circRNA表达异常，糖尿病相关应激源刺激可上调周细胞中cPWWP2A、cZNF532的表达，而在内皮细胞表达不受影响。进一步研究发现，cPWWP2A过表达使周细胞覆盖率增加，周细胞可通过旁分泌作用影响HRVECs的增殖、迁移和成管能力，间接调节内皮细胞的功能，使视网膜血管渗漏减轻，无细胞毛细血管及微动脉瘤减少。研究表明，cPWWP2A通过竞争性结合miR-579，调节视网膜Ang1、occludin、SIRT1的表达水平，增强周细胞的表达及募集，保护视网膜。SP1是在糖尿病应激条件下激活的一种转录因子，可与cZNF532的启动子结合并增强cZNF532的表达。在周细胞中cZNF532通过作为miR-29a-3p分子海绵，靶向提高NG2、LOXL2和CDK2的表达从而调节周细胞生物学活性，增强周细胞活力，增殖和分化并增强周细胞向内皮细胞募集，减轻糖尿病应激条件下的细胞凋亡。通过对cPWWP2A、cZNF532的研究，发现血管周细胞病变的表观调控新机制，挖掘了视网膜病变干预治疗的潜在靶标。因此，基于周细胞-内皮细胞串扰调控的治疗干预将为预防和保护糖尿病视网膜血管损伤提供一种新的方法，周细胞保护的DR治疗有望成为抗新生血管之外的又一新的治疗方向。

3.早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity, ROP)：一种以视网膜缺氧继发新生血管增殖为特点的早产儿眼底疾病[2]。随着医疗技术水平的发展，早产儿成活率增高，ROP成为儿童失明的重要原因[22]。氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy, OIR)小鼠模型是模拟ROP视网膜血管病变的主要动物模型。Zhou等[14]对 OIR视网膜进行测序发现，大量差异表达的circRNA在血管生成等生物学过程中富集。OIR小鼠视网膜中circRNA水平改变与细胞进程、细胞内酶活性、MAPK信号通路和肾素-管紧张素系统调节相关，并可能参与OIR病理性血管新生。此外，Liu等[19]研究发现在OIR模型中，cZNF609表达显著上调，cZNF609可能通过cZNF609/miR615-5p/MEF-2A轴调节宿主基因，参与眼部新生血管性疾病的发生。敲低cZNF609可以减少视网膜血管丢失和病理性血管新生，作为其潜在治疗靶标。然而，circRNA对ROP血管新生过程及其具体分子机制仍然缺乏了解，需要加大这方面的研究来全面验证结果并阐明其中潜在分子机制。

4.脉络膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)：一种累及RPE-脉络膜-巩膜复合体的常见眼部疾病[2]。年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration, AMD)、病理性近视、弱视等是引起CNV的主要原因，常导致视力丧失。Liu等[23]对CNV小鼠RPE-脉络膜-巩膜复合体进行微阵列分析，发现大量异常表达的circRNA，circRNA可能在CNV的发病机制中发挥至关重要的作用。渗出型AMD的特征是CNV形成。有研究发现，在缺氧应激后的ECs及激光诱导的CNV小鼠模型中cZBTB44的表达明显上调，cZBTB44作为miR-578分子海绵，抑制miR-578活性，导致VEGFA和VCAM1表达增加。敲低cZBTB44可降低内皮细胞的活力、增殖、迁移和成管能力，延缓CNV的发生、发展。敲低cZBTB44联合眼内抗VEGF类药物贝伐珠单抗注射可增加抗VEGF药物疗效，进一步抑制CNV的发展。综上所述，AMD有可能通过cZBTB44/miR-578/VEGFA、VCAM1轴调节脉络膜新生血管，并与贝伐珠单抗具有协同抗VEGF作用。此外，在渗出性AMD患者的临床样品中检测到cZBTB44表达失调，提示cZBTB44可能成为AMD的标志物并有助于AMD的临床诊断。

三、展 望

circRNA 可通过多种生物学机制调节基因的表达，参与眼部新生血管性疾病的发生、发展。对circRNA的研究可能丰富对生物机体遗传调控网络的认识，揭示了潜在的疾病发病机制，提供更多诊疗思路、判断预后及转归情况。目前，circRNA的研究主要集中在其生理病理过程中的表达变化，大多数研究仅局限于动物模型，且circRNA的功能研究及具体调控机制并未完全明了。因此，未来需要进一步研究基于人体标本中的circRNA在新生血管性疾病中的详细作用机制，并积极进行临床转化研究。积极进行相关检测试剂盒的研制，使circRNA在眼部新生血管性疾病的诊疗方面发挥无限的价值。此外，靶细胞的特异性circRNA敲除技术也存在着广阔的研究空间。目前，针对circRNA的研究广度已经铺开，而研究深度还远远不够，仍需研究者开展深入探索。