胰腺癌循环肿瘤细胞检测技术及临床应用前景

杨笑盈，秦 骋，赵邦博，李天浩，曹洪滔，王维斌

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院基本外科，北京 100730

手术切除可能是目前治愈胰腺癌的唯一方式，但由于其起病隐匿、早期症状不典型，且缺乏早期诊断的生物学标志物，多数患者就诊时肿瘤已发生局部侵袭或远处转移而失去最佳手术治疗时机，患者预后较差，5年生存率不足9%[1- 3]。此外，胰腺癌术后复发和转移未能早期发现，亦是导致患者预后不良的主要原因。因此，早期诊断并及时发现转移灶对指导胰腺癌临床治疗及改善患者预后至关重要。循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)是一类通过循环系统从局部肿瘤扩散至远处部位的肿瘤细胞，其保留了原发肿瘤的基本特征。目前认为，胰腺癌复发和转移的关键在于CTCs发生早期微转移，因此早期对血液中的CTCs进行检测有助于早期发现肿瘤远处转移。本文对目前胰腺癌诊断方法的应用现状、CTCs富集方法及CTCs检测在胰腺癌早期筛查、远处转移与预后评估中的应用前景进行梳理和总结。

1 常规胰腺癌评估方法

目前，影像学、糖链抗原19- 9(carbohydrate antigen19- 9，CA19- 9)以及组织病理学仍是胰腺癌筛查、临床分期、预后等的常规评估方法。

1.1 影像学

影像学检查主要包括CT、MRI或PET/CT，其对体积较大病灶的检出率较高，对于一些微转移灶如粟粒样微小转移灶，术前增强CT甚至PET/CT均无法发现，部分患者由于在术中才发现微转移灶而被迫中止手术。研究显示，对于微小肝转移灶，CT和MRI检查的灵敏度分别为69%和85%，约20%的患者通过影像学评估导致肿瘤分期被低估，影响治疗方案的选择[4- 5]。因此，仅通过影像学检查对胰腺癌早期诊断及病情评估具有局限性。

1.2 CA19- 9

CA19- 9是目前胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)诊断的首选肿瘤标志物，其血清水平与肿瘤分期相关，较高水平的CA19- 9常提示肿瘤处于中晚期。但CA19- 9表达受多种因素的影响，特异性较差，其在多种良性病变(如胰腺炎、急性胆管炎、肝硬化)和恶性肿瘤(如大肠癌、胃癌、膀胱癌、子宫鳞状细胞癌)中亦可异常升高[6]。此外，Lewis抗原(岩藻糖基转移酶)是CA19- 9的关键合成酶，约15%的人群该基因型表达异常，无法正常分泌CA19- 9，因此血清CA19- 9水平极低，导致临床假阴性[7]。最近有研究认为，CA19- 9与其他多种血清标志物(如蛋白质代谢物)联合检测可能有助于PDAC的早期诊断与疾病分期[8]。Bernard等[9]研究表明，CA19- 9结合循环肿瘤DNA以及患者性别、肿瘤转移部位等进行多因素分析可预测胰腺癌患者的总生存期(overall survival，OS)。但由于相关研究较少，确切研究结果尚需进一步验证。

1.3 组织病理

内镜超声引导下细针穿刺术(endoscopic ultrasonography guided fine-needle aspiration，EUS-FNA)是获取活检标本的首选检查，其阳性率约为80%～95%。内镜超声可发现毫米级微小病变，当影像学难以区分胰腺肿块性质时，EUS-FNA有助于胰腺占位病变的良恶性鉴别。但临床操作过程中，存在穿刺吸取标本量过少、涂片质量差等现象，导致假阴性结果。有研究认为对EUS-FNA获取的胰腺病理样本进行原癌基因(如K-ras)突变检测和抑癌基因(如p16、DPC4)缺失检测可提高其诊断的准确性。但EUS-FNA活体组织检查为有创检查，难以作为早期筛查的手段。因此，探究新的胰腺癌评估方法具有重要临床意义。

2 CTCs检测技术

目前研究认为CTCs是介导肿瘤转移的重要因素[10- 12]，检测血液中CTCs含量可能对胰腺癌的临床分期、疗效监测及预后评估均有帮助。目前CTCs的检测主要包括富集、分离、计数等步骤，而外周血中CTCs相较于血细胞含量极少，约为1/109～1/106，因此富集外周血中的CTCs是检测的重要环节[13]。近年来液体活检技术逐渐引起临床关注，外周血中CTCs的分离、富集技术亦得以快速发展。目前CTCs检测技术可通过CTCs的物理特性或生物学特性与血液中其他细胞进行区分，并将其富集、分离，但尚不能确定CTCs的最优检测方法。

2.1 基于物理特性

CTCs的物理性质主要包括其大小、可变形性、密度和电荷。研究表明，CTCs通常比其他血细胞体积更大且密度更低[14]。因此，可基于此将血液样本稀释并铺在培养基上，经离心、密度梯度法分离CTCs或利用CTCs体积较大的特性将其从血液中过滤出来。如ISET系统(Rarecells，Paris，France)使用具有8 mm圆柱形孔的聚碳酸酯膜过滤器从血液样本中富集CTCs[15]。

2.2 基于生物学特性

CTCs的生物学特性主要包括表面标志物及免疫亲和力，可利用不同抗体对血液中细胞表面抗原的吸附作用不同进行筛选，即使用与CTCs细胞膜表面特定抗原结合的抗体标记、包被磁性微珠，并施加磁场以将被标记的CTCs吸附至微珠上，以达到分离、富集CTCs的目的。此种基于表面抗原的富集方法分为“正选择”和“负选择”。正选择直接通过CTCs的表面标志物，如上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)阳性选择相应的抗体从而将其富集，负选择则通过相应的抗体标志物(主要为CD45)并耗尽血液中其他细胞(主要为白细胞)，从而筛选出CTCs[16]。目前使用较广泛的选择系统是CellSearch系统(Janssen Diagnostics Raritan，NJ)，该系统亦是目前美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准的唯一可用于检测分离CTCs的平台。CellSearch系统基于EpCAM抗体免疫磁性微珠捕获CTCs，并通过细胞角蛋白(cytokeratin，CK)8、18和19阳性，及血液特异性细胞表面标记CD45阴性，含有核成分DAPI阳性富集并鉴定分离CTCs[17]。

此方法存在一定的局限性，因不同患者之间CTCs表面蛋白差异性较大，即使同一患者的不同样本，EpCAM或CTCs上其他表面蛋白的表达仍存在异质性。Went等[18]报道，尽管78%的PDAC患者的CTCs表面蛋白上EpCAM为阳性，但CTCs可通过上皮间质转化降低其EpCAM的表达水平。

Khoja等[19]入选54例胰腺癌患者比较了CellSearch系统与ISET系统对CTCs富集、检测效率，结果显示ISET系统检出CTCs的患者数比CellSearch系统多，且对分离出的CTCs进行细胞计数发现，同样血液量中，ISET系统检出的CTCs数量明显更多。CTCs表面标志蛋白存在异质性可能是导致CellSearch系统检出率低的原因之一。ISET系统能检测出聚集成团的CTCs，但对于体积较小的CTCs(如小神经内分泌肿瘤细胞)则存在漏检的可能[20]。因此，目前尚无检测CTCs的标准方法，由于不同参考文献中的标准不同，难以比较不同系统的优劣。

3 CTCs在胰腺癌评估中的应用

2007年，Nagrath等[21]使用CellSearch系统富集、检测15例PDAC患者的CTCs，结果显示所有患者均可检测到CTCs(跨度范围9～831 CTCs/mL，中位数120 CTCs/mL)。Iwanicki-Caron等[22]对疑诊为PDAC的患者采用ScreenCell系统检测CTCs，并通过EUS-FNA收集可疑胰腺肿瘤细胞，结果发现85%的患者经EUS-FNA确诊为PDAC，其中70%可检测出CTCs，认为可考虑通过检测CTCs来诊断PDAC。Zhang等[23]使用hTERT启动子调节的溶瘤性单纯疱疹病毒- 1靶向端粒酶逆转录酶阳性的肿瘤细胞，检测不同临床阶段的胰腺癌患者CTCs表达情况，结果显示88.2%(15/17)的患者检出CTCs。Chang等[24]开发了一种平行微流控芯片，该芯片与免疫磁性吸附和基于物理特性过滤等不同策略相结合对胰腺癌患者的CTCs分离效果良好，胰腺癌患者的CTCs检出率为91.7%(11/12)，非小细胞肺癌患者的CTCs检出率为100%(38/38)。

上述研究表明，基于目前的检测技术对PDAC患者进行CTCs定性检测或定量分析具有可行性，但不同检测技术的结果仍存在较大差异。

3.1 筛查

Rhim等[25]采用黄色荧光蛋白谱系标记物标记了KPC小鼠的所有胰腺细胞，检测了胰腺上皮内瘤变(pancreatic intraepithelial neoplasia，PanIN)阶段小鼠血液中循环胰腺细胞(circulating pancreatic cells，CPCs)，发现CPCs表达的胰腺癌干细胞标志物CD44和CD24水平升高。此外，该研究发现CPCs可渗入骨髓、肾脏等组织，并表达Fsp1和Zeb1等间充质表面标志物，可作为胰腺癌患者死亡的独立预测因子。提示处于癌前病变时，胰腺肿瘤细胞即可离开原器官发生早期转移，CPCs可能是早期胰腺癌的标志物。在随后的研究中，Rhim等[26]在3个不同的受试者组(所有阶段的PDAC患者、肿瘤前囊性病变以及无癌对照人群)中捕获CTCs，结果显示PDAC患者和对照人群的CTCs检出率分别为73%(8/11)和0(0/19)，且40%(8/21)的肿瘤前囊性病变患者血液中可检测到CTCs，提示CTCs可用于胰腺癌的筛查。但Cauley等[27]通过ScreenCell系统对188例受试者进行CTCs检测，结果发现健康受试者未检出CTCs，胰腺癌、癌前病变及胰腺良性病变中，均有一定比例的患者可检出CTCs，且3组间CTCs检出率无显著性差异。因此，CTCs在胰腺癌早期诊断与筛查中的确切作用需进一步研究证实。

3.2 分期

CTCs水平对胰腺癌早期出现的远处转移具有重要提示意义。Kamande等[28]研究发现，转移性PDAC患者的CTCs水平显著高于局部可切除PDAC患者，但该研究纳入的受试者仅12例(包括7例转移性PDAC患者及5例局部可切除PDAC患者)。Court等[29]对126例胰腺癌患者术前进行CTCs检测，得到了相似结果，即合并隐匿转移性胰腺癌的患者与局灶性胰腺癌患者相比可检出更多的CTCs，差异具有统计学意义。但亦有少数研究结果显示CTCs水平与胰腺癌淋巴结转移、远处转移及TNM分期无关[30]。

胰腺癌患者预后较差主要归因于肿瘤较早出现远处转移，但尚无在无症状人群中甄别出早期胰腺癌的有效方法[31]。目前研究认为在胰腺癌发生转移的早期，即可在血液中检出CTCs，为胰腺癌早期诊断及转移筛查提供了可能性。但相关研究较少，且部分假阴性及假阳性结果的原因尚不清楚，确切结论及其应用价值需深入研究。

3.3 预后

通过不同平台检测CTCs的研究均表明，CTCs可能是PDAC患者预后的独立影响因素。Soeth等[32]通过巢式CK20实时PCR在52例PDAC患者(52/154，33.8%)中分离出了CTCs，并发现这些患者的OS比未分离出CTCs的患者显著缩短。Kurihara等[33]使用CellSearch系统对26例胰腺癌患者进行CTCs检测，结果显示11例检出CTCs，且此类患者的OS显著缩短。de Albuquerque等[34]在34例患者的研究中亦得到了一致的结果。Bidard等[35]进行了一项多中心随机对照临床试验，该研究纳入79例局部晚期非转移性PDAC患者，分别接受吉西他滨单药治疗或吉西他滨+厄洛替尼治疗，通过CellSearch系统在2个不同的时间点(基线和治疗2个月时)进行CTCs检测。结果表明，CTCs的总体阳性率为11%；多因素分析显示任意时间点CTCs阳性是局部晚期胰腺腺癌OS缩短的危险因素，但其对患者的无进展生存期(progression-free-survival，PFS)无显著影响。Gao等[36]通过非EpCAM依赖性方法富集、检测胰腺癌患者CTCs，发现CTCs数目升高(≥3 CTCs/7.5 mL)患者的OS较CTCs数目较低患者(<3 CTCs/7.5 mL)明显缩短(10.2个月 比 15.2个月)，且多因素分析显示CTCs数目升高是胰腺癌患者OS较短的危险因素(HR=4.547，P=0.016)。Poruk等[37]基于物理特性富集并分离出CTCs后，对panCK和波形蛋白分别进行免疫荧光染色，比较了上皮型CTCs(CK阳性)和间质型CTCs(波形蛋白阳性)患者的预后情况，发现上皮型CTCs与较短的OS密切相关(P<0.01)，但间质型CTCs与OS无相关性(P=0.39)。大量研究证实，CTCs阳性不仅提示胰腺癌患者OS缩短，且是PFS缩短的危险因素[38- 40]。

有部分研究认为，从门静脉分离出的CTCs与全身循环系统分离出的CTCs可能存在潜在差异。Catenacci等[41]在18例胰腺癌或胆管癌患者中均可检出门静脉CTCs，而其中仅有22%的患者外周血可检出CTCs。Bissolati等[42]在对20例胰腺癌患者的研究中，9例(45%)患者可检出CTCs，其中5例仅在门静脉中检出CTCs、3例同时在门静脉和外周血中检出，1例仅在外周血中检出；随访3年可知，相比门静脉CTCs阴性的患者，CTCs阳性者具有更高的肝转移率。Tien等[43]收集了41例PDAC患者术中门静脉和外周血样本，仅发现门静脉CTCs数量升高是PDAC患者术后6个月肝转移的重要预测指标(P=0.002)。上述结果表明，门静脉血液中的CTCs比外周血中的CTCs更易被检出，且与PDAC潜在转移的关系更密切。但上述研究样本量较小，且检测方法不完全一致，从门静脉分离出的CTCs是否更有助于临床对胰腺癌患者进行预后判断仍需进一步研究。

4 小结

胰腺癌作为一种恶性程度高、预后差的肿瘤，在过去数十年的探索中患者预后并未获得明显的改善。由于存在特殊的解剖学位置及肿瘤细胞成分相对较低等特点，胰腺癌组织活检较为困难，而CA19- 9等分子生物学标志物及MRI、CT、PET/CT等影像学技术在胰腺癌的早期诊断和转移筛查中均存在一定局限性。CTCs作为保留原发肿瘤特性的一类肿瘤细胞，其在胰腺癌早期即可在血液中检测到，且获取方便、可多次收集，为胰腺癌的早期诊断、远处转移筛查提供了新思路，且在实时监测肿瘤进展、对治疗的反应以及预后评估中具有较好的应用前景[44]。但目前尚缺乏CTCs富集、分离的标准平台和方法，且其在胰腺癌患者中的应用多为小样本量研究，需进行更多、更大规模的前瞻性临床试验进一步验证，以发掘其潜在价值。

作者贡献：杨笑盈、秦骋撰写论文初稿；王维斌负责论文设计；赵邦博负责论文修改；李天浩、曹洪滔负责文献查阅工作；所有作者均参与本文修订。

利益冲突：无