先天性外中耳畸形(17)*——组织工程耳再造研究进展

张天宇 何爱娟

先天性外中耳畸形俗称小耳畸形，是颅面部常见的出生缺陷之一，全世界每10 000名新生儿中有0.83～17.4人罹患该疾病[1]。目前对于先天性外中耳畸形仍以自体肋软骨移植耳再造为主要治疗手段，但自体肋软骨获取创伤大，有继发气胸、胸廓畸形等风险，这些局限性使得软骨组织工程技术进行耳再造成为方向。19世纪80年代后，组织工程技术为人体器官的修复和重建展开了一个新篇章[2]，这一技术融合了生命科学、材料科学、信息工程科学、化学、物理学等多个学科，各学科之间的相互结合、相互促进，使得软骨组织工程技术呈现迅猛发展的态势[3]。自1997年曹谊林等[4]成功在裸鼠背上再生出人耳郭形态软骨以来，组织工程耳再生获得了诸多重要进展，耳郭组织工程软骨修复技术在动物体内的有效性已被大量实验所验证[3，5]，临床应用尝试也获得了一定进展[6,7]，但要实现真正的临床转化和广泛应用仍有很多问题待解决。本文就目前软骨组织工程耳再造取得的研究进展、面临的技术瓶颈及亟待解决的科学与技术问题进行综述，为软骨组织工程耳再造的后续研究提供参考。

1 软骨组织工程耳再造的发展史

组织工程技术兴起于上世纪80年代，但直至1992年，人耳形态的组织工程耳郭再生才首次被Vacanti等[8]报道;此时的组织工程耳郭软骨不仅不够精致，植入裸鼠体内后形变、收缩的比例很高。为了解决形态维持问题，曹谊林等[4]通过将组织工程耳郭软骨与钛网外支架结合从而解决了组织工程耳郭软骨的体内形态维持问题。能够精确塑形，从而构建出具有特定形态的组织器官是组织工程技术的优势之一。耳郭形态复杂且精致，组织工程耳郭软骨再生的成功是形态控制在组织工程领域获得突破的重要标志。随着材料学的发展，到了1998年，Ting等[9]首次尝试了应用纤维蛋白凝胶(天然材料)复合牛关节软骨细胞成功在裸鼠体内再生了耳郭形态软骨,但由于凝胶材料的力学强度低、降解速率快，耳郭形态维持并不理想。尽管如此，这一研究结果开启了天然材料在耳郭软骨组织工程中的应用尝试，为后续复合材料的研究与应用提供了基础。随后，Saim等[5]尝试应用Pluronic F-127水凝胶复合新鲜耳软骨细胞(未经体外扩增)结合外科皮下隧道制备技术,进行猪自体软骨注射移植，成功在猪体内再生出具有耳轮形态的软骨组织。这是组织工程耳郭软骨再生在大动物体内获得成功的重要标志,但这一方法也存在诸多局限性，操作过程复杂、不能再生完整的耳郭形态软骨、再生的软骨不均质等,因此，有关这一方法的应用后续鲜有报道。

2002年，Haisch等[10]首次报道利用体外扩增技术获得足够量的人鼻中隔软骨细胞，且将这些扩增细胞与PLLA-PGLA支架材料复合后能再生成熟的耳郭形态软骨组织。尽管这一研究是建立在裸鼠模型之上的软骨再生，但细胞扩增技术的建立及人体细胞的应用不仅解决了细胞数量问题，还从动物细胞的探索过渡到了人体细胞的研究，大大推动了软骨组织工程临床应用的进程。随后，Kamil[11]在2003年通过对体外构建技术的改良，同时适当延长体外培养时间，最终在体外构建出力学强度尚可，且具有正常人大小的耳郭形态软骨，改写了既往只能构建小体积软骨的历史。2004年，为了获得具有足够力学强度的组织工程耳郭软骨，Shieh等[12]尝试了应用新西兰大白兔耳软骨细胞复合聚己内酯(poly e-caprolactone，PCL)支架材料进行组织工程耳郭软骨再生，最终在裸鼠体内再生出力学强度好、三维形态精确的耳郭软骨，初步解决了再生软骨的力学强度及形态维持问题。在动物试验获得成功的基础上，2009年，Yanaga等[7]通过获取小耳畸形患者的残耳软骨细胞，体外扩增后进行自体腹部皮下注射以促进其成熟,6个月后取出雕刻成耳郭支架用于耳再造;术后早期随访发现，患者的耳郭形态维持良好，与自体肋软骨耳再造相比具有更好的弹性。尽管Yanaga的研究中只有4例患者，且再造耳的长期效果如何未见后续报道，但这些成果开启了组织工程耳再造临床试用的先河。时隔9年，周广东等[6]探索性研究出了含PCL内核的PGA/PLA-PCL复合支架，有效解决了组织工程软骨力学强度不足、植入体内后形态难以维持这一难题;与此同时，他们还通过延长体外诱导时间初步解决了支架材料的体内炎症反应问题;在解决力学强度及炎症反应这两大难题后，该课题组最终开展了真正意义上的组织工程耳再造临床试验研究。经过2年半的随访，他们发现部分患者获得了较为满意的耳再造效果。这项研究成果将组织工程耳再造的临床转化进程又向前推进了一步。

经过近30年的发展，组织工程耳再造通过逐个解决软骨再生面临的多个难题，从无免疫动物的异体移植到免疫完全的大动物自体移植，最后逐渐走到了临床试验研究，使广大研究者看到了组织工程技术在耳再造应用中的曙光[13]。这不仅是组织工程耳再造的重要进展，更是组织工程领域的重要突破，这些重要成果还推动了组织工程软骨在鼻再造等其它领域的临床应用与研究[14]。

2 组织工程耳再造面临的难题

软骨种子细胞、支架材料、培养体系等仍是组织工程耳郭软骨再生的三大要素。尽管组织工程软骨再生技术在众多学科的推动下获得了很多重要发展，但时至今日，这三大要素仍有很多技术瓶颈需要突破，很多科学问题仍需阐明。

2.1软骨种子细胞 早期的软骨种子细胞来源主要有软骨细胞和骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cells, BMSCs)。近年来随着细胞生物学的快速发展及研究者对各种细胞的深入理解，越来越多具有软骨再生潜能的细胞被尝试应用于软骨修复重建领域,如:小耳畸形患者的残耳软骨细胞、脂肪干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞(induce pluripotential stem cells, iPSCs)、经血源子宫干细胞(menstrual blood-derived mesenchymal stem cells, MenSCs)等,但在组织工程耳郭软骨再生领域，正常软骨细胞、残耳软骨细胞、BMSCs等仍是目前最常用的种子细胞来源。正常软骨细胞是软骨组织工程应用最早的种子细胞，也是应用最广泛的细胞[15]。目前通过体外扩增技术，仅需获取很小的软骨组织，体外扩增后便可获得足够数量的种子细胞[16];但软骨细胞在体外扩增培养过程中极易出现去分化、软骨再生能力迅速丧失等现象，这无疑给软骨细胞的进一步应用带来了巨大挑战[17]。很多研究者发现通过利用三维培养、添加细胞因子等方法可使去分化的软骨细胞发生重分化、功能逆转，这些研究成果为解决软骨去分化问题提供了重要参考依据[15,17]。但近两年来研究发现，尽管三维培养、重分化诱导等方法可以促进去分化软骨细胞重分化，但重分化后的软骨细胞并不能完全恢复到天然软骨细胞的功能状态[17]。因此，如何避免软骨细胞体外扩增过程中的去分化现象仍是组织工程耳再造面临的一大挑战。

除正常软骨细胞外，有研究发现小耳畸形患者的残耳软骨细胞增殖能力及软骨再生能力均极强[18]，比较残耳软骨细胞与正常耳软骨细胞再生的软骨组织发现，二者在生化成份及组织特性上并未见明显差异[19]。由此推测残耳软骨细胞可能是组织工程耳再造更为理想的种子细胞。尽管如此，小耳畸形者中有部分存在基因异常[20]，而这些异常是否会影响组织工程耳郭的长期转归，目前尚未有研究报道。

BMSCs具有良好的软骨分化潜能、体外增殖能力强、获取创伤小、无供区继发组织缺损、可重复取材等优势，这使得BMSCs成为目前最有应用前景的种子细胞[21]。但BMSCs在皮下微环境中的血管化、骨化问题仍是限制其进一步应用的重要瓶颈[22]。利用软骨细胞与BMSCs共培养技术可有效防止BMSCs皮下环境的骨化现象，但这一方法还需获取患者的软骨组织，同样会造成继发组织缺损，因此，共培养技术的临床应用意义并不大。此外，还有很多研究利用基因敲除、人工材料负载抗血管因子等方法来抑制BMSCs皮下骨化[22]，但这些试验仅在动物体内获得了成功，其人体内的安全性、有效性仍需进一步验证。

2.2支架材料 支架材料是细胞赖以生存的载体，同时也是细胞表型得以维持的重要保障。目前应用于组织工程耳郭软骨再生的支架主要有天然生物材料、人工合成材料及复合材料三种类型。常用的天然生物材料有藻酸盐、壳聚糖、胶原、脱细胞基质材料及透明质酸等[23，24]。这些材料无明显的细胞毒性，生物相容性好，植入体内后无明显炎症反应或仅引起轻微的炎症反应，因此，软骨细胞与之复合植入体内后软骨再生较为稳定。然而，这些材料力学性能较差、体外可塑性差、体内降解快、形态维持困难[8]，因此，在耳郭软骨再生中的应用受到了很大限制。很多研究者尝试通过交联技术、光敏技术、温敏技术、冻干技术等来提高胶原材料的可塑性及力学强度[23,25]，经过这些改进，材料的性能确实获得了较大提高，但要想获得足够抵抗耳再造术后的皮肤张力，且其降解速率与软骨再生的速度相匹配的理想材料，材料学家们仍需努力。

除天然材料外，人工合成材料，如：多孔聚乙烯(Medpor)、聚己内酯(PCL)、聚羟基乙酸(PGA)和聚乳酸(PLA)等，在耳郭组织工程中都是较常用的材料。这些合成材料不仅来源广、易于获取，更重要的是具有可塑性强、可精确控制形态、力学性能好、植入体内后形态维持良好等优势[8]；人工合成材料的这些特点非常适合作为耳郭形态软骨构建的支架材料。同样，这些材料也有不足之处，最大的缺点是组织相容性较差，植入体内后材料本身及其降解产物，会激发机体的异物炎症反应从而干扰软骨的体内再生[8]。此外，材料缺乏柔韧可屈曲的生理特性、材料外露、感染等问题也是限制这些材料进一步应用的关键因素。因此，如何增加人工合成材料的组织相容性仍是面临的挑战。

为克服上述天然材料和人工合成材料各自的不足，取长补短，近年来复合材料已经逐渐成为研究的热点[26]。研究者们尝试了以不同方式(物理或化学方法)将两种或者两种以上的天然材料和人工合成材料进行复合，从而获得组织相容性较好、形态可控、力学性能合适的复合材料，如：丝蛋白-藻酸盐三维多孔耳郭支架、胶原/PLA、壳聚糖/PLA和胶原/壳聚糖/PLA等[8]。这些研究成果为软骨再生提供了更多的材料选择空间，但这些支架材料在人体内的安全性及有效性仍未充分证实。因此，要实现临床应用转化仍有待验证，性能更优的材料仍有待开发。

2.3培养体系 组织工程软骨的再生过程就如同植物生长一样，除了要有良好的种子(种子细胞)、合适的土壤(支架)，还要有足够的营养物质(细胞因子等)才能枝叶繁茂。目前在耳郭软骨组织工程中，细胞的扩增和表型维持、软骨的再生和成熟都依赖细胞因子的作用，联合应用多种生长因子重分化诱导软骨细胞或定向诱导间充质干细胞分化成软骨仍是软骨再生的主流技术。转化生长因子-β(TGF-β)、骨形态发生蛋白(BMP)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF)等是当前软骨再生体系中最常用的细胞因子[27，28]，但对这些细胞因子的认知，大部分是来源于其在间充质干细胞向软骨方向分化的作用。因此，这些细胞因子在天然软骨细胞或者分化成熟的软骨细胞中如何起作用，何时起作用、有无空间效应，目前仍不明确，在此基础之上建立的培养体系很难将组织工程软骨培养到天然软骨组织的成熟水平。此外，基因修饰技术(将软骨生长因子基因通过载体转入靶细胞内或者将携带软骨生长因子的载体附着于生物支架上，使其能够适时、稳定、持续地表达,从而促进软骨再生)也是改良软骨再生体系的研究热点[29,30]，但该技术的安全性及有效性仍未获得充分证实。因此，如何找到理想的软骨再生体系仍是耳郭软骨组织工程面临的重要难题。

3 展望

近年来，尽管耳郭软骨组织工程获得了诸多进展，但大规模的临床应用仍未获得突破，主要原因在于还有很多技术瓶颈待突破，很多科学问题仍待解决。软骨细胞及BMSCs仍是未来耳郭软骨组织工程的首选种子细胞，因此，找到影响软骨细胞去分化的关键分子机制、明确BMSCs皮下环境骨化的关键调控机制可能是解决种子细胞问题的重要途径。在支架材料方面，由于天然材料和人工材料都有无法克服的局限性，因此，复合材料的研发和应用可能是获得理想支架材料的重要途径。此外，在软骨组织构建的过程中，结合应用3D打印技术，不仅能精确控制形态，还有助于细胞与材料的相互作用、简化材料的制备工艺，从而获得更理想的软骨再生效果。最后，通过研究天然耳软骨细胞的生长发育调控机制，或者先天性外中耳畸形的发病机制，可能是优化软骨再生体系、提高构建软骨的质量及功能的重要切入点。组织工程学是一门交叉学科，只有多学科共同发展、互相促进才能加快软骨组织工程耳再造技术的临床应用转化进程。