人类免疫缺陷病毒解剖学病毒储存库与检测方法的研究进展

赖菁贞，张洪，梁浩，宁传艺

1. 广西艾滋病防治研究重点实验室， 广西壮族自治区 南宁 530021； 2. 广西医科大学生命科学研究院，广西壮族自治区 南宁 530021； 3. 广西医科大学公共卫生学院，广西壮族自治区 南宁 530021； 4. 广西医科大学护理学院，广西壮族自治区 南宁 530021

自20世纪90年代提出高效抗反转录病毒治疗(highly active anti-retroviral therapy，HAART)，人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染由一种高致死性疾病转变为可控的慢性感染性疾病。目前只要HIV感染者坚持服用HAART药物，其体内的病毒复制基本可被抑制，这意味着病毒对感染者免疫功能的破坏可暂时被终止，感染者免疫力能够逐步恢复[1-2]。维持一定水平血药浓度的抗病毒药物虽能长期抑制病毒复制，但HAART不能彻底清除体内病毒，最主要原因是HIV感染者体内病毒潜伏感染于细胞中形成的病毒储存库，这些潜伏感染的病毒能够躲避人体免疫系统的识别[3-4]。鉴于此，本文对HIV解剖学储存库及其检测方法进行综述，期望为获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)防治工作提供资料。

1 HIV储存库

潜伏病毒是指整合在宿主DNA上的前病毒，它们平时不产生病毒，但是在合适的信号刺激下能够释放病毒颗粒。潜伏感染细胞是潜伏病毒的载体细胞，是病毒储存库的最小实体，这个定义仅限于静息感染细胞[5]。尽管HAART在抑制HIV复制方面非常有效，但在治疗期间，病毒仍然能潜伏于作为宿主的静息CD4+T细胞中，一旦停止HAART，病毒复制便会迅速反弹。多个研究表明，在长期接受HAART(10～30个月)的HIV感染者体内仍然存在能够产生病毒的HIV储存库，即使其血浆病毒载量已经低于检测阈值[6-8]。

HIV感染者体内的病毒储存库在感染早期即可形成，主要以两种形式存在：一种是未整合进入人类基因组的HIV DNA，主要是游离于细胞核内的1-长末端重复序列(long terminal repeat，LTR)环和2-LTR环[9-10]，能进行稳定的低水平复制，然而其尚未整合进入宿主DNA，故存在的半衰期仅为数周，无法形成长期存在的储存库；另一种是完全整合进入宿主基因组的HIV前病毒，其有较高的稳定性和隐蔽性，能够长期存在于宿主静息细胞DNA内，是清除HIV感染的主要障碍，也是病毒储存库形成的主要原因。Brodin 等[11]使用队列研究设计和深度测序的方法， 选取10例HIV感染者，在其确诊后5年提取血浆病毒RNA(尚未开始抗病毒治疗)，并在其抗病毒治疗成功抑制HIV至少2年后从其外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中分离出前病毒DNA，对其中的p17gag序列进行纵向检测和比较，经系统进化分析后发现，抗病毒治疗后的DNA序列中约60%与抗病毒治疗开始前血浆中的RNA变异是相似的。Abrahams 等[12]也比较了9名接受治疗的HIV感染者外周血CD4+T细胞中可复制的活性病毒序列和治疗前血液中循环的病毒序列，结果发现，从系统进化树上来看，治疗后潜伏期诱发的特定病毒与治疗开始前的病毒在遗传上大约有71%的序列是相似的。这些研究说明病毒储存库在患者体内相当稳定，且不易被清除。

2 HIV解剖学储存库

HIV储存库不仅指某些特定的细胞类型，还包括具体组织、器官等生理解剖学储存库，例如中枢神经系统、肺、生殖系统、消化道相关淋巴组织、肾等[13-14]。解剖学病毒储存库的存在导致这些组织、器官由于持续存在低水平病毒复制而产生炎症或者容易诱发机会性感染。

2.1 中枢神经系统(central nervous system, CNS)

HIV在CNS中的感染机制仍未明确。HIV可通过感染单核细胞或CD4+T细胞后随血液迁移至CNS，或因为炎症前细胞因子和病毒蛋白的分泌改变血-脑屏障上皮细胞的通透性，促进HIV进入CNS，或利用受感染的上皮细胞，通过转胞吞作用到达另一侧，或利用反应性星形胶质细胞诱导上皮细胞凋亡，通过释放病毒蛋白来改变血-脑屏障的通透性[15]。最终，HIV可在CNS内的血管旁巨噬细胞、小胶质细胞和星状细胞形成潜伏感染，构成CNS病毒库[16-17]。其中，小胶质细胞是存活时间较长的细胞，可存活数年，可致其成为主要的CNS病毒潜伏库[17-18]。同时，相对于其他解剖学储存库，血-脑屏障的存在使得抗病毒药物很难进入CNS，从而无法清除CNS中的游离HIV。对病毒准种的遗传分析揭示了HIV在CNS中存在区室化复制特点[19-21]。

2.2 肺

肺和支气管是非常重要的HIV潜伏病毒库[22-23]。肺也是AIDS患者发生机会性感染的重要器官之一。除了在大部分患者肺泡巨噬细胞中可以检测到HIV以外[23]，感染动力学表明，病毒释放的早期峰值随着可检测到的HIV Gag蛋白和HIV RNA的减少而降低，并达到低水平稳定状态，从而形成潜伏病毒库[23]。早期研究结果表明，AIDS患者支气管肺泡灌洗液细胞中的HIV前病毒DNA水平超出外周血白细胞的7.6倍[24]。Brenchley等[25]研究显示，被HIV感染的支气管肺泡灌洗细胞比例与被感染的血细胞比例相近。Costiniuk等[26]对接受HAART且体内病毒复制被抑制的患者支气管肺泡灌洗细胞进行检测，发现其中的前病毒DNA较血液中的更加富集。对感染猿猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus, SIV；HIV的猿类同系病毒)的恒河猴的研究表明，肺和肠道内的病毒血症水平最高，仅次于淋巴结，在HAART有效抑制血液病毒期间也是如此[27]。对HIV准种的分析也提示肺中嗜巨噬细胞HIV-1变异存在区室化[20]。

2.3 生殖系统

睾丸也被认为是接受抗病毒治疗患者HIV解剖学储存库。早期研究报道，可从接受HAART患者的精子中分离出有复制能力的HIV-1，尽管其血浆中的HIV DNA已无法检测到，这提示男性生殖道可能是HIV的病毒储存库之一[28]。近年来，Jenabian等[29]研究报道，从抗病毒抑制的所有6名研究对象的至少一个睾丸中检测到HIV总DNA，且其中5名研究对象能检测到整合的HIV DNA。此外，与PBMCs相比，HIV感染和未感染研究对象的睾丸组织中的效应记忆T细胞增加，且睾丸中T细胞的趋化因子受体5(chemokine receptor 5，CCR5)表达明显增加。有研究利用基因进化分析研究睾丸组织和血液来源的HIV的多样性和区室化特征。随着HIVnef完整序列的进化，60%研究对象的血液与睾丸组织中的HIV呈现明显的区室化，提示睾丸可能是HIV的解剖学病毒库[30]。

有研究对异性性传播感染HIV-1 7个月内的72名妇女宫颈黏膜擦拭采样，同时采集外周血，利用二代测序技术比较宫颈和外周血样本中的HIV-1多样性，发现生殖道内获得的HIV-1具有更高的多样性[31]。Cantero-Pérez等[32]的研究发现，接受抗反转录病毒治疗(anti-retroviral therapy，ART)的HIV阳性女性宫颈组织中含有高水平的病毒DNA和RNA。以上研究提示，宫颈很可能也是重要的解剖学病毒库。

2.4 其他解剖学病毒库

除上述3个研究较多的解剖学储存库以外，还有很多其他的HIV解剖学病毒库，如淋巴结、肾脏、眼等。长期ART过程中外周血和淋巴结中持续存在的被HIV-1感染的细胞混合均匀，淋巴结中的病毒不存在区室化现象，且淋巴结中的HIV-1潜伏库持续存在是因为HAART之前被感染的细胞持续增殖，而非HAART期间病毒持续复制[33]。一项关于外周滤泡辅助T(peripheral follicular helper T, pTFH)细胞的研究表明，大量累积于淋巴结的pTFH细胞是非常重要的HIV库，其中潜伏感染X4-嗜性HIV-1的患者罹患机会性感染的风险更大[34]。此外，Canaud等[35]的研究揭示HIV-1可感染移植肾，进而在肾脏形成潜伏库；HIV还可以从泪液、结膜上皮细胞、角膜、视网膜等眼部重要分泌物/组织中分离出来[36]。

3 HIV储存库的检测方法

3.1 病毒生长实验(viral outgrowth assays, VOA)

定量病毒生长实验(quantitative VOA, QVOA)可以检测静息CD4+T细胞在受到刺激时释放活性病毒的细胞数量，被认为是确定接受抗病毒治疗的HIV感染者体内病毒储存库大小的金标准[37]。在实际应用中，研究人员发现，QVOA不能检测出有缺陷的前病毒，常低估具有复制能力的病毒储存库的大小[38]，所以研究人员进一步优化QVOA并提出定性定量VOA(qualitative QVOA, Q2VOA)[39]和多轮刺激VOA(multiple stimulation VOA, MS-VOA)[40]。Q2VOA在QVOA的基础上对检测到病毒颗粒的培养孔内的上清液进行env区测序及中和实验，在对具有复制能力的病毒进行定量检测的同时分析其遗传和生物多样性[39]。MS-VOA增加了对细胞的刺激次数，使CD4+T细胞在经过多轮植物血凝素(phytohemagglutinin, PHA)刺激后复制、释放出更多病毒颗粒，可用于评估先前在T细胞激活反应中增殖而不产生感染性病毒的细胞是否可以通过额外刺激释放病毒，从而更加准确地估计储存库的大小[40]。然而VOA所需时间较长，且需大量血液(120～180 mL)或其他组织细胞[37-38]，并须在生物安全三级实验室中进行[41]。

3.2 TZA(TZM-bl based assay)

TZA是基于TZM-bl细胞对血液中的HIV储存库进行定量检测的实验方法[42]。使用强病毒潜伏激活剂激活从外周血分离的静息CD4+T细胞，经洗涤、计数后，将这些激活的细胞与TZM-bl报告细胞共培养，通过检测实验组和阴性对照组中β-半乳糖苷酶的表达量，对具有复制能力的HIV-1进行定量。TZA可用于估计可被诱导的潜伏病毒部分[42-43]，相比于VOA，其基于细胞系的检测体系及对患者外周血需求量小，可以实现高通量的储存库检测，并用于儿童及组织样本中的储存库检测[44]，但是TZA必须设立阴性对照组才能对病毒储存库进行估算。

3.3 微滴数字聚合酶链反应(droplet digital polymerase chain reaction, ddPCR)

ddPCR是近年来新兴的一种数字PCR技术，通过将反应体系无限稀释至 1 000 万份，其中每个微滴不含待检靶病毒分子或只含一个待检靶病毒分子[45]。经PCR扩增后，对每个微滴逐个进行检测，有荧光信号的微滴判为1，没有荧光信号的微滴判为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的比例即可计算出靶病毒分子的起始拷贝数或浓度。通过ddPCR对HIV-1总DNA进行定量是临床研究中常用的一种评估病毒储存库的方法[46]，可以对多种生物样本中的HIV-1 DNA进行检测[13,47-48]，可检测到含量极低的病毒序列[45]，且无需标准品即可检测出靶病毒分子的起始拷贝数或浓度[45]。但是，由于绝大多数可检测到的HIV-1基因组不能进行复制，因此用HIV-1 DNA定量会过高估计病毒储存库的大小[38]。

3.4 Tat/rev诱导有限稀释试验(Tat/rev induced limiting dilution assay, TILDA)

TILDA是一种基于PCR的实验方法，可以估计产生Tat/rev多重剪接RNA(multiply spliced RNA, msRNA)的HIV-1感染CD4+T细胞数[49]。该试验将分子方法与限制稀释试验相结合，提高检测的敏感性，能够从少量血液样本中准确定量检测临床相关病毒储存库大小。但是，尽管所有释放病毒颗粒的细胞都在产生tat/revmsRNA，但反过来未必正确，所以TILDA可能过度估计病毒储存库的大小[49]。此外，TILDA依赖于HIV基因组一个高度可变区域的扩增，实验中使用的引物和探针可能因不能识别所有的病毒准种而不能准确估计病毒储存库大小[49]。

4 结语

HIV储存库的存在导致HIV感染至今无法被治愈，HIV感染的持续存在导致宿主机体特定解剖学储存库易发生多种机会性感染，而HIV储存库与机会性感染之间的关系尚不明确，因此有必要开展HIV储存库与机会性感染相互作用的机制研究。此外，关于HIV储存库检测方法缺乏统一的检测金标准，存在严重高估或者低估病毒储存库的争论。因此，有必要开发更加准确、简便、快速的HIV储存库检测技术，以进一步指导临床上AIDS的治疗及预后评估。