基于UPLC-Q/TOF-MS的小儿消积止咳口服液化学物质组快速辨识研究

吴美琪，刘建庭，许 浚, 3，张铁军, 3*，贾景明*

基于UPLC-Q/TOF-MS的小儿消积止咳口服液化学物质组快速辨识研究

吴美琪1，刘建庭2，许 浚2, 3，张铁军2, 3*，贾景明1*

1. 沈阳药科大学 中药资源教研室，辽宁 沈阳 110016 2. 释药技术与药代动力学国家重点实验室（天津药物研究院），天津 300462 3. 天津药物研究院 天津市中药质量标志物重点实验室，天津 300462

基于UPLC-QTOF-MS系统解析小儿消积止咳口服液物质组。采用ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱，以0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液进行梯度洗脱，柱温40 ℃，体积流量0.4 mL/min，进样量5 μL；质谱条件为XEVO-G2 QTOF质谱仪，电喷雾离子源，正、负离子模式扫描。通过对照品确认、高分辨质谱数据分析及文献检索比对，共鉴别出108个化学成分，包括37个黄酮类、11个生物碱类、13个三萜类、4个木脂素类、2个香豆素类、5个简单苯丙素类、4个苯乙醇苷类、14个有机酸类以及18个包括氨基酸、聚炔类等其他化学成分。建立的方法可系统、准确、快速辨识小儿消积止咳口服液中多种化学成分，为后续对口服液质量及药效研究提供物质基础。

小儿消积止咳口服液；UPLC-Q/TOF-MS；化学物质组；黄酮类；生物碱类；三萜类

小儿消积止咳口服液是依据“食积咳嗽”论治理论研制的儿科用中药制剂[1]，为国家中药保护品种，由炒山楂、槟榔、枳实、蜜枇杷叶、瓜蒌、炒莱菔子、炒葶苈子、桔梗、连翘、蝉蜕10味药组成，具有清热肃肺、消积止咳的功能，临床用于小儿饮食积滞、痰热蕴肺所致的咳嗽、夜间加重、喉间痰鸣、腹胀、口臭等症[2]。目前对小儿消积止咳口服液的研究多为其联合用药对小儿肺炎等疾病的临床疗效和安全性的观察[3-5]，对于其物质组的研究未见报道。近年来液质联用技术在中药复方中的应用愈见广泛，为复方中有效物质的探寻提供了强有力的支持，本实验采用UPLC-Q/TOF-MS技术，对小儿消积止咳口服液的化学成分进行了全面表征，共鉴别或表征出108个化学成分，揭示了其化学物质组成，为后续研究提供实验支持。

1 仪器与试剂

ACQUITY UPLC液相色谱仪、XEVO-G2 QTOF质谱仪；ME104/02电子天平（METTLER TOLEDO公司）；G&G JJ100电子天平（美国双杰兄弟公司）；高速中药粉碎机（浙江瑞安市永历制药机械有限公司）；SB-3200DTN超声波清洗机（宁波新芝生物科技公司）。

枸椽酸（批号100396-201603，质量分数100%）、金丝桃苷（批号111521-201205，质量分数93.3%）、芦丁（批号100080-200707，质量分数100%）、绿原酸（批号110753-200413，质量分数98%）、氢溴酸槟榔碱（批号111684-202003，质量分数99.8%）、柚皮苷（批号110722-201815，质量分数90%）、熊果酸（批号110742-201421）、异槲皮苷（批号111809-201403，质量分数98%）、3,29-二苯甲酰基栝楼仁三醇（批号111931-201804，质量分数98.8%）、木犀草素（批号111520-201605，质量分数99.6%）、芥子碱硫氰酸盐（批号111702-202006，质量分数99%）、槲皮素-3--β--葡萄糖-7--β--龙胆双糖苷（批号111854-201905，质量分数94.5%）、桔梗皂苷D（批号111851-201708，质量分数95%）、连翘酯苷A（批号111810-201707，质量分数95%）购自中国食品药品检定研究院；原儿茶酸（批号110809-200604，质量分数95%）、表儿茶素（批号110878-200102，质量分数95%）、齐墩果酸（批号110709-200505，质量分数95%）、异鼠李素（批号110860-200608，质量分数95%）、阿魏酸（批号0773-9910，质量分数95%）购自中国药品生物制品检定所；槲皮素（批号MUST-18101104，质量分数95%）、辛弗林（批号MUST-14082611，质量分数98%）、芸香柚皮苷（批号MUST- 17030408，质量分数99.2%）、橙皮素（批号MUST- 16040814，质量分数95%）、新橙皮苷（批号MUST-17040707，质量分数98.1%）、柚皮素（批号MUST-16032406，质量分数95%）购自成都曼斯特生物科技有限公司；连翘酯苷B（批号ps10061801，质量分数99%）购自成都普思生物科技有限公司；橙皮苷（批号P06D9F77001，质量分数98%）、槲皮苷（批号P19D10F106420，质量分数98%）购自上海源叶生物科技有限公司。小儿消积止咳口服液及其原料药材：炒山楂、槟榔、枳实、蜜枇杷叶、瓜蒌、炒莱菔子、炒葶苈子、桔梗、连翘、蝉蜕10味药材饮片均由山东鲁南厚普制药有限公司提供，经天津药物研究院中药现代研究部张铁军研究院鉴定，均符合《中国药典》2020年版一部有关规定。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

2.1.1 小儿消积止咳口服液溶液的制备 取小儿消积止咳口服液2 mL，置10 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.2 药材溶液的制备 炒山楂、槟榔、连翘打粉过五号筛；枳实、炒葶苈子打粉过四号筛；炒莱菔子、蝉蜕、瓜蒌打粉过三号筛；蜜枇杷叶、桔梗打粉过二号筛。准确称量与制剂同等生药量的处方中各药材分别置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇20 mL，超声30 min，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取各对照品适量，置25 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制成质量浓度约为40 μg/mL的混合对照品溶液。

2.3 色谱条件

采用ACQUITY UPLC系统，色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters美国）色谱柱；以0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）进行梯度洗脱，0～5 min，5%～13% A；5～20 min，13%～25% A；20～25 min，25%～60% A；25～35 min，60%～90% A；柱温40 ℃，体积流量0.4 mL/min，进样量5 μL。

2.4 质谱条件

质谱鉴定采用XevoTMG2Q-TOF系统。离子源为ESI源，正、负离子模式检测；脱溶剂气体积流量为800 L/h；脱溶剂气温度为400 ℃；锥孔气体积流量为50 L/h；源温度为120 ℃；正离子毛细管电压为3.0 kV，负离子毛细管电压2.5 kV；锥孔电压为35 V。校准液采用亮氨酸脑啡肽[M＋H]+（/556.277 1）、[M－H]–（/554.261 5）进行实时质量校准，体积流量为5 μL/min。为了获得物质母离子及碎片离子信息，采用MSE模式进行样品测定，参数如下：1通道的扫描范围/50～1500，扫描时间1.0 s，扫描延迟20 ms，碰撞能量6 eV；2通道的扫描范围/50～1500，扫描时间1.0 s，扫描延迟20 ms，碰撞能量30～50 eV。

2.5 实验结果

通过对照品的比对，结合准分子离子、二级碎片离子信息、相关文献以及数据库[6]，共鉴别出108个化学成分，包括37个黄酮类、11个生物碱类、13个三萜类、4个木脂素类、2个香豆素类、5个简单苯丙素类、4个苯乙醇苷类、14个有机酸类以及18个其他类成分[7-26]。小儿消积止咳口服液中化学成分的基峰色谱图见图1，具体成分信息见表1。

图1 基于UPLC-Q/TOF-MS的小儿消积止咳口服液化学成分基峰色谱图

表1 小儿消积止咳口服液的化学成分LC-MS数据

续表1

续表1

续表1

*与对照品比对确认

*confirmed by control substance

2.5.1 黄酮类化合物 小儿消积止咳口服液中黄酮类化合物多在负离子模式下确定，共鉴定出36个黄酮类化合物，其中31、36、37、39、42、43、47～49、51、55、59、61、62、67、69、71、100、103、104、106为黄酮（醇）类化合物；30、52、53、56、63、64、68、72、74、75、84～86、89、90为二氢黄酮（醇）类化合物。黄酮类化合物主要以游离形式或者与糖结合成糖苷形式存在，断裂方式主要有CO、CO2等中性离子丢失、C环发生RDA裂解以及糖基的断裂等[8,19]。

在负离子模式下，黄酮类化合物分子C环发生RDA裂解，产生碎片A1, 3-、B1, 3-2部分，如图2所示[20]。以化合物49为例，在负离子模式下，保留时间为6.74 min，一级质谱信息显示其准分子离子峰为/609.145 6，二级谱图中主要碎片离子为/463.087 8、301.034 7，其裂解规律为/609 [M－H]−，二级扫描裂解产生了/463 [M－H－C6H10O4]−、301 [M－H－C6H10O5]−，分子式为C27H30O16，进一步对比对照品确定化合物57为芦丁，可能的裂解途径见图3，二级质谱信息见图4。

图2 黄酮类化合物C环裂解示意图

2.5.2 生物碱类化合物 生物碱类化合物断裂方式有CH3、H2O等中性碎片丢失、RDA裂解和重排等方式，小儿消积止咳口服液中生物碱类化合物均在正离子模式下确定，共鉴定出11个生物碱类化合物。以化合物4为例[19]，在正离子模式下，R为0.63 min，一级质谱信息显示其准分子离子峰为/168.103 1，二级谱图中主要碎片离子为/150.092 0 [M＋H－H2O]+，进一步对比对照品确定化合物4为辛弗林，可能的裂解途径见图5，二级质谱信息见图6。

图3 芦丁的质谱裂解途径

图4 芦丁的MS/MS质谱图

2.5.3 苯乙醇苷类化合物 苯乙醇苷类化合物主要发生糖基的丢失，小儿消积止咳口服液中共鉴定出毛柳苷、连翘酯苷E、连翘酯苷B和连翘酯苷A 4个化合物，均来自单味药连翘。以化合物60为例，正离子模式下保留时间为8.11 min，一级质谱信息显示其准分子离子峰为/647.194 7，二级谱图中主要碎片离子为/471.147 7、325.091 2、163.040 8，其裂解规律为/647 [M＋Na]+，二级扫描裂解产生了/471 [M＋H－C8H10O3]+，/325 [M＋H－C14H20O7]+,/163 [M＋H－C20H30O12]+，分子式为C29H36O15，与对照品质谱信息对比进一步确认化合物60为连翘酯苷A，可能的裂解途径见图7，质谱信息见图8。

图5 辛弗林的质谱裂解途径

2.5.4 有机酸类化合物 有机酸类化合物在负离子模式下主要以[M－H]−的准分子离子峰形式存在，其中酚酸类化合物以CO2或H2O中性分子的丢失为主。小儿消积止咳口服液中共鉴定出14个有机酸，包括化合物2、10、13、18、20、21、29、32～35、54、87、97。以化合物32为例[19]，负离子模式下R为2.87 min，一级质谱信息显示其准分子离子峰为/353.087 3，二级谱图中主要碎片离子为/191.056 5，推测是奎尼酸C7H12O6（/192.063 4）失去1个质子，绿原酸是由奎尼酸和咖啡酸C9H8O4（/180.042 3）脱水组成的缩酚酸，进一步对比对照品确定化合物32为绿原酸，可能的裂解途径见图9，二级质谱信息见图10。

图6 辛弗林的MS/MS质谱图

图7 连翘酯苷A的质谱裂解途径

图8 连翘酯苷A的MS/MS质谱图

图9 绿原酸的质谱裂解途径

图10 绿原酸的MS/MS质谱图

3 讨论

小儿消积止咳口服液是一种中药复方制剂，其中君药为山楂、槟榔，具有消食健胃、行气利水、化浊调脂作用，山楂中含有多种有机酸，口服可促进胃中消化酶的分泌，并能增强酶的活性，促进消化吸收，此外山楂中还有含有胃蛋白酶激动剂、淀粉酶等，可增强蛋白酶、胰脂肪酶的活性，促进胃肠蠕动[27]。现代药理学研究表明，槟榔能够提高胃动力低下大鼠的胃排空率和小肠推进率，促使胃肠运动趋向正常[28]；胃肠道分布有丰富的胆碱能受体，其兴奋是调节胃肠动力的重要因素，有研究证实[29]，槟榔碱能兴奋交感神经，刺激胆碱M受体，促使人体唾液分泌的增加、出汗和兴奋及胃肠道蠕动，有助于提高人体的消化功能。臣药枇杷叶、连翘、桔梗、瓜蒌等起到清肺止咳、涤痰解毒、润燥滑肠之功效，桔梗中粗皂苷对局部炎症有刺激作用，如桔梗粗皂苷ig对角叉莱胶及醋酸所致的大鼠足肿胀，有较强的抗炎作用，桔梗总皂苷还具有很好的镇咳祛痰活性，提示其可能为桔梗镇咳祛痰主要活性部位[30]；连翘中连翘酯苷能够对实验中科萨奇病毒等起到了有效的抑制功效，让大肠杆菌等感染模型的动物死亡率显著降低，同时对于出现内毒素引起的发热家兔模型以及酵母发热大鼠模型体温明显降低，从而证实连翘酯苷具有解热以及抗感染的功效[31]。佐药枳实则起到破气消积、化痰散痞之功效，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等黄酮类成分是枳实理气、行滞、平喘、抗炎的重要活性成分，具有促胃动力的作用，可改善功能性消化不良大鼠的胃排空和小肠推进[32]；葶苈子具有泻肺平喘、行水消肿作用；莱菔子则起到消食除胀、降气化痰等功效；蝉蜕具有疏散风热、利咽作用，韩国学者的研究证明，从蝉蜕中分离得到的2个乙酰多巴胺二聚体成分均有抗炎和抗氧化活性[33]；使药桔梗可以引药上行，共奏清热肃肺、消积止咳之功效。

本实验建立了一种简单、快速的UPLC-Q/TOF MS技术方法，对小儿消积止咳口服液的化学成分进行了全面表征和鉴定，共鉴别或表征出108个化学成分，并对化合物来源进行归属，21个来源于炒山楂，10个来源于槟榔，11个来源于蜜枇杷叶，13个来源于连翘，8个来源于瓜蒌，8个来源于桔梗，29个来源于枳实，9个来源于炒莱菔子，7个来源于炒葶苈子，4个来源于蝉蜕。黄酮类成分多数来源于枳实、炒山楂和炒葶苈子，木脂素成分均来自连翘，香豆素成分均来自枳实，简单苯丙素类成分多数来源于炒莱菔子，生物碱类成分多数来源于槟榔，三萜皂苷类均来自桔梗，其他三萜类多数来源于枳实和炒山楂，苯乙醇苷类均来自连翘，有机酸类多数来源于炒山楂，其中脂肪酸均来自于炒葶苈子。本实验为阐明小儿消积止咳口服液的药效物质基础和质量控制指标的选择提供实验依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Rapid identification of chemical material basis of Xiao’er Xiaoji Zhike Oral Liquid based on UPLC-Q/TOF-MS

WU Mei-qi1, LIU Jian-ting2, XU Jun2, 3, ZHANG Tie-jun2, 3, JIA Jing-ming1

1. Department of Traditional Chinese Medicinal Resources, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China 2. State Key Laboratory of Drug Delivery and Pharmacokinetics, Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300462, China 3. Tianjin Key Laboratory of Quality Marker of Traditional Chinese Medicine, Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300462, China

Objective To analyze the chemical material basis of Xiao’er Xiaoji Zhike Oral Liquid (小儿消积止咳口服液) by UPLC-Q/TOF-MS. Methods The separation was performed on ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm, Waters US) column with gradient elution of 0.1% formic acid acetonitrile-0.1% formic acid aqueous solution. The column temperature was 40 ℃, the flow rate was 0.4 mL/min, the injection volume was 5 μL, and the mass spectrometry condition was XEVO-G2 Q/TOF mass spectrometer, electrospray ion source, positive and negative mode scanning. Results A total of 108 chemical components were identified by reference substance confirmation, high mass spectrometry data analysis and the comparison of related literature. The chemical material basis was composed of 37 flavonoids, 11 alkaloids, 13 triterpenes, 4 lignanoids, 2 coumarins, 5 simple phenylpropanoids, 4 phenethyl alcohol glycosides, 14 organic acids, and 18 other compound including amino acids and polyacetylenes. Conclusion This study can help identify various chemical constituents of Xiao’er Xiaoji Zhike Oral Liquid systematically, accurately and rapidly, which provides the material basis for the follow-up study on the quality and pharmacodynamics of the oral liquid.

Xiao’er Xiaoji Zhike Oral Liquid; UPLC-Q/TOF-MS; chemical material basis; flavonoids; alkaloids; triterpenes

R284.1

A

0253 - 2670(2021)23 - 7117 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.23.006

2021-06-09

“中医药现代化研究”重点专项（2019YFC1711201）；国家自然科学基金重点项目（81830111）；国家重大新药创制计划课题（2018ZX09721004-006）；中央引导地方科技发展专项（20ZYCGSN00200）

吴美琪，女，硕士研究生。E-mail: wumeiqi2021@163.com

贾景明，男，教授。E-mail: jiajingming@163.com

张铁军，男，研究员。E-mail: zhangtj@tjipr.com

[责任编辑 王文倩]