火炭母提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性及稳定性研究

杨艾华 - 宋姗姗 - 王微微 -

(遵义医科大学基础医学院，贵州 遵义 563000)

金黄色葡萄球菌是一种常见的食源性致病菌，广泛分布于空气、水、灰尘及人和动物的排泄物等自然环境中[1-2]。据报道，中国20%～25%的细菌性食物中毒事件是由金黄色葡萄球菌所引起[3]，其存活能力强，能以生鲜肉、蛋、奶制品及速冻产品等食品为介质生长繁殖，并产生肠毒素、杀白细胞素和表皮脱落素等外毒素，对人体健康造成严重威胁[4-5]。此外，金黄色葡萄球菌还能附着在物体表面形成生物被膜，增加了细菌本身对抑菌剂耐受性，以生物被膜状态存在的金黄色葡萄球菌能够抵抗多种不利的生存条件，在食品生产及加工环境中常规的清洗与消毒手段难以完全去除，为食品安全带来巨大隐患[6-7]。

在食品中添加防腐剂是防止其变质、腐败的重要手段之一。但苯甲酸盐、亚硝酸盐、丙酸盐等食品领域常用的化学防腐剂，长时间或过量使用时有较多副作用[8]。所以，具有安全无毒、作用高效及来源广泛等优点的天然防腐剂已越来越受到研究学者的关注与重视。研究[9]发现，植物提取物含有的多糖、多酚、生物碱、挥发油等多种活性成分，均具有不同程度的抑菌及抗氧化作用，可作为天然来源的食品防腐剂，防止食品污染并延长其保质期，在食品行业具有广阔的应用前景。

火炭母为蓼科蓼属植物(PolygonumchineseL.)，其味酸甘，性微凉，具有清热除湿、凉血解毒、利肝明目、活血舒筋等功效[10]。火炭母作为民间常见的中草药在中国分布广泛，作为凉茶等保健品的主要原料之一，在广东、广西等地区得到普遍使用[11-12]。目前，关于火炭母的研究大多集中在成分提取、临床治疗等方面[13-15]。研究拟以火炭母提取物为对象，评价其对金黄色葡萄球菌的抑菌活性，并对影响其抑菌活性的因素进行初步探讨，以期为火炭母作为天然防腐剂原料在食品防腐领域的开发及应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

火炭母：采集于遵义医科大学校园内，经上海中医药大学中药研究所吴立宏研究员鉴定为蓼科植物火炭母植株；

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus, CMCC26003)：遵义医科大学微生物学与免疫学实验室；

氯化钠、氯化钙、氯化钾、氢氧化钠、浓盐酸：分析纯，成都化学试剂厂；

营养琼脂培养基、LB液体培养基：北京奥博星生物技术有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

旋转蒸发仪：RE-2000A型，上海亚荣生化仪器厂；

超净工作台：BCM-1000A型，苏州安泰空气技术有限公司；

离心机：TD5M-WS型，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；

立式压力蒸汽灭菌器：YXQ-LS型，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；

酶标仪：ELx800型，美国博腾仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料预处理 选取健康的火炭母植株茎叶洗净，置于50 ℃烘干，粉碎得火炭母粉末，密封保存备用。

1.2.2 火炭母提取物制备 参照文献[16]。准确称取一定量火炭母粉末，按照m火炭母∶V水=1∶10 (g/mL)加入蒸馏水，室温浸泡过夜。加热煮沸1 h，纱布过滤，再加入蒸馏水煮沸。重复2～3次，合并滤液后用真空泵抽滤，滤液再经40 ℃旋转蒸发仪减压浓缩得提取物浸膏，置于冰箱4 ℃冷藏备用。使用前，取适量提取物浸膏配制成100 mg/mL溶液，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后使用。

1.2.3 菌悬液制备 从营养琼脂平板上挑取金黄色葡萄球菌单菌落，接种于LB液体培养基中，37 ℃振荡培养至对数生长期，调整细菌浓度为1.5×106CFU/mL。

1.2.4 抑菌圈测定 采用牛津杯法[17]。将100 μL菌液均匀涂布于平板上，取无菌牛津杯轻置于平板表面，再将100 μL火炭母提取物加入牛津杯，阳性对照组为0.5%山梨酸钾溶液，阴性对照组为无菌水，每组试验重复3次，37 ℃过夜培养后观察结果，测量抑菌圈直径。

1.2.5 最小抑菌浓度MIC测定 采用二倍稀释法[17]。将火炭母提取物用无菌肉汤培养基稀释为1～64 mg/mL等不同浓度，取96孔板每孔中加入100 μL同上制备的1.5×106CFU/mL金黄色葡萄球菌菌悬液，然后各孔加入100 μL 不同浓度的火炭母提取物，以不添加菌液和火炭母提取物的肉汤培养基作为对照，每组设3个重复，37 ℃过夜培养后，肉眼观察各孔中细菌生长情况，再以酶标仪测定OD600 nm值[18]。

1.2.6 不同理化因素对火炭母提取物抑菌活性的影响

采用质量浓度为8 mg/mL的火炭母提取物进行该部分试验，具体方法如下：

(1) 温度对火炭母提取物抑菌活性的影响：将火炭母提取物分别在20，40，60，80，100 ℃的水浴中处理30 min，以未处理组作为阳性对照，不加样组作为阴性对照，以金黄色葡萄球菌为指示菌，每组试验设3个重复，采用96孔法分别检测不同温度对火炭母提取物抑菌活性的影响[19]。

(2) 紫外线对火炭母提取物抑菌活性的影响：将火炭母提取物敞开放置在20 W紫外灯光下，分别照射10，20，30，40，50，60 min，以未处理组作为阳性对照，不加样组作为阴性对照，以金黄色葡萄球菌为指示菌，每组试验设3个重复，采用96孔法分别检测紫外线对火炭母提取物抑菌活性的影响[19]。

(3) pH对火炭母提取物抑菌活性的影响：分别用1 mol/L的盐酸和1 mol/L氢氧化钠溶液将火炭母提取物的pH调为 4.0，6.0，8.0，10.0，以未处理组作为阳性对照，不加样组作为阴性对照，以金黄色葡萄球菌为指示菌，每组试验设3个重复，采用96孔法分别检测pH对火炭母提取物抑菌活性的影响[19]。

(4) 金属离子对火炭母提取物抑菌活性的影响：将火炭母提取物分别与0.1 mol/L氯化钠、氯化钾和氯化钙溶液按V提取物∶V盐溶液=1∶1混合，使火炭母提取物终质量浓度为8 mg/mL，以未处理组作为阳性对照，不加样组作为阴性对照，以金黄色葡萄球菌为指示菌，每组试验设3个重复，采用96孔法分别检测各金属离子对火炭母提取物抑菌活性的影响[19]。

1.2.7 数据处理 使用Graphpad Prism 8.0及Excel软件进行作图和单因素方差分析，*表示具有显著性差异(P<0.05)；**表示具有极显著性差异(P<0.01)。

2 结果与分析

2.1 火炭母提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌作用

2.1.1 抑菌圈直径 按照药敏试验以抑菌圈直径进行敏感性判断[20]。结果显示，与阳性对照相比，100 mg/mL的火炭母提取物对金黄色葡萄球菌具有更好的抑菌效果，抑菌圈直径为(18.30±0.12) mm，表现为高度敏感，与欧阳蒲月等[21]的研究结果一致。

表1 火炭母提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径

2.1.2 最小抑菌浓度 如图1所示，37 ℃培养后，除空白组无细菌生长，其余试验组均有细菌生长，其中1，2，4 mg/mL质量浓度下有细菌生长，且与阳性对照组相比无明显差异。采用单因素方差分析，与未加样的阴性对照相比，在8～64 mg/mL质量浓度范围内的火炭母提取物对金黄色葡萄球菌生长具有极显著差异(P<0.01)，其中8 mg/mL质量浓度下细菌生长受到抑制，即最低抑菌浓度为8 mg/mL，且火炭母提取物的浓度越高，抑菌效果越强。

2.2 理化因素对火炭母提取物抑菌活性的影响

2.2.1 温度对火炭母提取物抑菌活性的影响 以金黄色葡萄球菌的OD600 nm值为指标探讨火炭母提取物的抑菌活性[22]。如图2所示，与阳性对照组相比，20～80 ℃处理过的火炭母提取物抑菌活性较为稳定；而经过100 ℃处理后的火炭母提取物抑菌活性有所下降，但仍具有一定抑菌效果，可能是因高温造成提取物中的抑菌有效成分发生变化[23]。与阴性对照组相比，所有试验组均有极显著的抑菌活性(P<0.01)，表现出良好的热稳定性，但保存及使用时不宜长时间处于高温环境，避免抑菌效果减弱。

图1 火炭母提取物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度Figure 1 MIC of Polygonum chinense Linnextracts on S. aureus

图2 温度对火炭母提取物抑菌活性的影响

2.2.2 紫外线对火炭母提取物抑菌活性的影响 如图3所示，随着紫外线照射时间延长，火炭母提取物的抑菌活性相对稳定，与未处理组相比无显著变化。而与未加药的阴性对照组比较，所有试验组均有极显著的抑菌活性(P<0.01)。说明火炭母提取物中的活性物质能够对抗紫外线的破坏，对紫外线处理表现出良好的稳定性，实际应用中可使用紫外线对提取物进行灭菌处理，同时亦不会影响其本身的抑菌能力。因此，火炭母提取物运用在食品加工及防腐过程中可结合紫外线共同进行杀菌处理。

2.2.3 pH对火炭母提取物抑菌活性的影响 如图4所示，随着环境pH的升高或降低，火炭母提取物的抑菌活性都出现下降，可能因为酸性或碱性条件破坏了提取物中抑菌活性物质的结构或者活性[24]；而与未加药的阴性对照组比较，所有试验组均有极显著的抑菌活性(P<0.01)，说明火炭母提取物表现出良好的酸碱稳定性。

图3 紫外线对火炭母提取物抑菌活性的影响

图4 pH对火炭母提取物抑菌活性的影响

2.2.4 金属离子对火炭母提取物抑菌活性的影响 如图5所示，与阳性对照组相比，火炭母提取物在0.1 mol/L NaCl和0.1 mol/L KCl条件下，抑菌活性有所下降，但与阴性对照组相比仍具有极显著(P<0.01)抑菌活性。而在0.1 mol/L CaCl2条件下，火炭母提取物丧失抑菌活性，原因可能是某些金属离子本身可与抑菌成分螯合，从而降低其抑菌能力[25]。不同金属离子与火炭母提取物中的活性物质结合形成的络合物在结构和稳定性上存在一定差异，导致对其抑菌活性产生不同的影响[26-27]。因此，火炭母提取物在应用于食品保鲜或防腐过程中，应考虑到食品本身或包装中涉及到的金属离子种类和数量等问题。

图5 金属离子对火炭母提取物抑菌活性的影响

3 结论

火炭母提取物对金黄色葡萄球菌具有显著的抑菌活性，其最小抑菌浓度为8 mg/mL。经过不同温度加热处理后，火炭母提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性略有减弱，但仍然保持一定的敏感性；而随着紫外线照射时间的延长，火炭母提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性相对稳定，说明火炭母提取物对紫外线不敏感，在食品加工及防腐过程中可结合紫外线共同进行杀菌处理；在不同pH条件下，火炭母提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性略有下降，但仍具有一定的抑菌活性；Ca2+、Na+、K+等不同金属离子对火炭母提取物抑菌活性的影响具有明显差异，其中Na+、K+能够降低其抑菌活性，而Ca2+的加入导致其活性丧失。总体上，火炭母提取物表现出了良好的体外抑菌活性和稳定性。

由于火炭母提取物中成分较为复杂，后续将继续对火炭母提取物的安全性、抑菌机制及活性成分组成等进行研究，以期为火炭母资源的开发和利用打下基础。