瑞舒伐他汀联合普罗布考对老年缺血性脑卒中患者Th17/Treg细胞轴功能的影响

吕钊鹏，宁翔，杨洪瑞，王娟，亓蕾，盛林，朱华

1山东大学第二医院心内科，济南250033；2山东大学附属济南市中心医院急诊科；3山东省职业卫生与职业病防治研究院 山东第一医科大学(山东省医学科学院)

研究表明，缺血性脑卒中与慢性免疫炎症反应，特别是与辅助性T细胞(Th17)/调节性T细胞(Treg)轴功能失衡密切相关[1-2]。Th17能够分泌白介素(IL)-17、IL-6、IL-23及肿瘤坏死因子α(TNF-α)等促炎因子，RORγ是其重要的转录因子。Treg是维持机体免疫耐受的重要细胞之一，主要分泌IL-10等抑炎因子，Foxp3是其特征性转录因子。血脂代谢异常是缺血性脑卒中重要而独立的危险因素，可直接引起Th17数量增加、Treg数量减少，导致Th17/Treg细胞轴功能失衡[3]；同时血液中氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)浓度增加可诱发氧化应激反应[4]，进一步加剧Th17/Treg细胞轴功能失衡，促进缺血性脑卒中的发生发展。ox-LDL是血液中的低密度脂蛋白胆固醇在缺血、缺氧条件下，经过氧化修饰转变而成，具有很强的免疫原性，是反映机体氧化应激水平的重要生物学指标。研究表明，ox-LDL与初发及复发的老年缺血性脑卒中患者Th17/Treg细胞轴功能失衡密切相关[5]。他汀类药物是缺血性心脑血管疾病防治的一线降脂药，在降低血脂的同时还具有抗炎作用，对失衡的Th17/Treg细胞轴功能有一定的改善作用，但效果仍不理想。普罗布考是一种合成的含有双酚基的新型降脂药物，用于治疗低密度脂蛋白胆固醇增高的高脂血症，同时，其还具有较强的抗氧化功能，是临床上较为常用的一种降脂抗氧化药物。他汀类药物与普罗布考联合应用能否有效改善缺血性脑卒中患者的Th17/Treg细胞轴功能失衡状态，目前尚不清楚。本研究对老年缺血性脑卒中患者采用瑞舒伐他汀联合普罗布考联合治疗，观察他汀类降脂药物联合抗氧化药物对Th17/Treg细胞轴功能失衡的影响，并分析其作用机制与ox-LDL的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2014年3月—2017年10月山东大学第二医院收治的老年缺血性脑卒中患者237例，男141例、女96例，年龄60～82(68.16±4.86)岁。纳入标准：年龄≥60岁；经头颅CT或MRI确诊的缺血性脑卒中；未联合使用过他汀及抗氧化药物。排除标准：病情持续恶化；不能口服治疗药物；颅内占位病变；多系统萎缩症；结缔组织疾病；多发性硬化症；恶性肿瘤；急慢性炎症；近期使用影响免疫反应药物；合并心功能不全、呼吸衰竭、肾功能衰竭、肝硬化；对瑞舒伐他汀及普罗布考过敏。将患者随机分为对照组、他汀组、联合组各79例。对照组男44例、女35例，年龄(68.61±4.78)岁，合并高血压59例、糖尿病18例，有吸烟史17例、饮酒史24例；他汀组男48例、女31例，年龄(67.48±4.30)岁，合并高血压59例、糖尿病17例，有吸烟史16例、饮酒史21例；联合组男49例、女30例，年龄(68.80±4.30)岁，合并高血压61例、糖尿病18例，有吸烟史20例、饮酒史23例。三组性别、年龄、合并高血压及糖尿病情况、吸烟史、饮酒史比较，差异均无统计学意义，具有可比性。三组BMI、血压、心率、血脂、血糖比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1、表2。本研究属于前瞻性研究，通过山东大学第二医院伦理委员会审查和同意，受试者均签署知情同意书。

表1 三组BMI、血压、心率、血糖指标比较

表2 三组血脂指标比较

1.2 治疗方法 对照组给予常规缺血性脑卒中治疗，包括降压、降糖、改善脑循环、营养脑神经、吸氧及支持治疗等；他汀组在常规治疗基础上给予瑞舒伐他汀10 mg/d顿服；联合组在常规治疗基础上给予瑞舒伐他汀10 mg/d顿服，并给予普罗布考500 mg，2次/天口服，连续7 d。

1.3 外周血单个核细胞(PBMCs)的制备 于患者开始接受口服药物治疗的前1天(基线)及给予普罗布考治疗7 d后采用肝素抗凝真空管采集空腹肘静脉血10 mL，Ficoll密度梯度离心法分离PBMCs，经盼蓝染色法测定细胞活力>95%。调整细胞密度为1×107/mL，4 ℃保存备用。

1.4 PBMCs中Th17、Treg检测 采用流式细胞术。将PBMCs调整至2×106/mL，加入佛波酯(50 μg/L)、离子霉素(1 μmol/L)和莫能霉素(500 μg/L)孵育4 h，用于检测Treg的PBMCs调整至1×106/mL，分别等分为测定管和对照管，测定管分别加入APC-CD25抗体和(或)FITC-CD4抗体，避光孵育后加入FITC-IL-17A用于检测Th17，加入PE-Foxp3抗体用于检测Treg。对照管中分别加入同型对照抗体。所有标记抗体均购自eBioscience公司。采用FAC-SAria型流式细胞仪进行检测。

1.5 PBMCs中RORγt、Foxp3 mRNA表达检测 采用RT-PCR法。提取PBMCs总RNA，合成cDNA第一链。RORγt、Foxp3及GAPDH引物序列见表3。cDNA第一链合成及实时定量PCR操作步骤均按试剂盒说明书操作。PCR循环参数：95 ℃ 10 s、95 ℃ 1 s、58 ℃ 5 s、72 ℃ 35 s，共40个循环。以GAPDH为内参基因，采用2-ΔΔCt计算目的基因相对表达量。

表3 RORγt、Foxp3、GAPDH引物序列

1.6 血浆Th17/Treg细胞轴相关效应因子检测 于患者开始接受口服药物治疗的前1天(基线)及给予普罗布考治疗7 d后，采用EDTA抗凝真空管采集空腹肘静脉血5 mL，1 500 r/min离心，分离血浆，-80 ℃储存备用。采用酶联免疫吸附法检测Th17/Treg细胞相关效应因子IL-17、IL-6、IL-10、IL-23、TNF-α水平。试剂盒均购自eBioscience公司，操作步骤严格按说明书进行。

1.7 血脂水平检测 采用瑞士罗氏MODULARP800全自动生化分析仪检测TC、TG、HDL-C、LDL-C。采用酶联免疫吸附法检测ox-LDL。

2 结果

2.1 三组治疗前后外周血Th17和Treg频率变化值比较 见表4。他汀组及联合组治疗后较治疗前Th17比例下降幅度、Treg比例上升幅度及联合组Th17/Treg下降幅度显著高于对照组(P均<0.01)。与他汀组比较，联合组Th17比例下降幅度及Treg比例上升幅度显著增高(P均<0.01)。

表4 三组治疗前后Th17、Treg比例及Th17/Treg变化值比较[M(P25，P75)]

2.2 三组治疗前后PBMCs中RORγt、Foxp3 mRNA表达变化值比较 见表5。与对照组比较，他汀组及联合组RORγt mRNA表达下降幅度及Foxp3 mRNA表达上升幅度显著增高(P均<0.01)。与他汀组比较，联合组RORγt mRNA表达下降幅度及Foxp3 mRNA表达上升幅度显著增高(P均<0.01)。

2.3 三组治疗前后血浆IL-17、IL-6、IL-10、IL-23、TNF-α水平变化值比较 见表6。与对照组比较，他汀组及联合组IL-17、IL-23、TNF-α下降幅度和IL-10上升幅度显著增高，联合组IL-6下降幅度显著增高(P均<0.01)。与他汀组比较，联合组IL-17、IL-23、TNF-α下降幅度及IL-10上升幅度显著增高(P均<0.01)。

表6 三组治疗前后血浆IL-17、IL-6、IL-10、IL-23、TNF-α水平变化值比较[M(P25，P75)]

2.4 三组治疗前后血浆TC、TG、HDL-C、LDL-C、ox-LDL水平变化值比较 见表7。与对照组比较，联合组HDL-C上升幅度及LDL-C和ox-LDL下降幅度显著增高，他汀组LDL-C下降幅度显著增高(P均<0.01)。与他汀组比较，联合组LDL-C和ox-LDL下降幅度显著增高(P均<0.01)。

表7 三组治疗前后血浆TC、TG、HDL-C、LDL-C、ox-LDL水平变化值比较[M(P25，P75)]

2.5 血浆Δox-LDL与Th17/Treg细胞轴相关指标变化值的相关性 Δox-LDL与ΔTh17比例、ΔTh17/Treg、ΔRORγt mRNA、ΔIL-17、ΔIL-6、ΔIL-23、ΔTNF-α呈负相关(r分别为-0.471、-0.367、-0.412、-0.477、-0.332、-0.319、-0.383，P均<0.01)；与ΔTreg比例、ΔFoxp3 mRNA、ΔIL-10呈正相关(r分别为0.411、0.396、0.328，P均<0.01)。

3 讨论

缺血性脑卒中是临床常见的老年性疾病，由于各种原因所致的血液供应障碍导致局部脑组织缺血缺氧，使患者发生不同程度的神经功能障碍，如偏瘫、肢体感觉障碍、意识障碍，严重者甚至导致死亡，危险性极高。在缺血性脑卒中的病理进展过程中，炎症及氧化应激反应具有重要作用，可加重脑组织损伤和神经功能紊乱，降低患者的日常生活能力，严重影响预后和康复。瑞舒伐他汀是一种选择性3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，具有降低LDL-C及减轻炎症反应和氧化应激反应的作用。但其使用剂量与血药浓度和浓度—时间曲线下面积呈线性关系，因此单独使用低剂量瑞舒伐他汀可能会降低其治疗效果，而大剂量使用又会导致不良反应增加，故临床上建议协同其他药物治疗。普罗布考是一种人工合成的抗氧化剂，能够与氧离子结合成稳定的酚氧基团，具有较好的脂溶性和强大的抗脂质过氧化、抗炎及保护内皮功能的作用[6-7]。为了观察他汀类药物与普罗布考联合应用对抑制缺血性脑卒中患者炎症反应和氧化应激反应的效果，我们进行了相关研究。

Th17及Treg均由初始CD4+T细胞分化而来，二者在功能上相互制约。Th17与Treg比例的变化对炎症性疾病的发生发展及临床预后具有决定性作用。研究表明，缺血性脑卒中患者外周血PBMCs中的Th17及Treg比例及其功能严重失衡[8]。本研究结果显示，对照组治疗前后外周血Th17、Treg比例及Th17/Treg比值无明显差异，他汀组治疗后Th17比例较治疗前显著降低。而联合组治疗后与治疗前比较，Th17比例及Th17/Treg比值显著降低，Treg比例显著上升。联合组Th17、Treg比例及Th17/Treg比值治疗前后变化值显著高于对照组和他汀组，这表明联合组的Th17及Treg的分布得到明显改善。

RORγt、Foxp3分别是Th17和Treg特有的转录因子，RORγt mRNA和Foxp3 mRNA表达分别与Th17和Treg细胞活性密切相关。LIU等[9]报道，对高血压伴颈动脉粥样硬化患者给予瑞舒伐他汀治疗后，患者RORγt mRNA表达显著降低，Foxp3 mRNA表达显著升高。本研究结果显示，他汀组采用瑞舒伐他汀治疗后，虽然RORγt mRNA表达下降，但Foxp3 mRNA表达变化不明显，可能与他汀类药物对Th17及其功能的影响更显著有关[10]。而联合组治疗后，RORγt mRNA表达下降更明显，Foxp3 mRNA表达明显上升。这提示与单独应用舒瑞伐他汀治疗比较，舒瑞伐他汀联合普罗布考可能会更有效地抑制缺血性脑卒中患者的Th17活性而提高Treg活性，改善Th17/Treg细胞轴功能。

Th17分泌的效应因子如IL-17、IL-6、IL-23、TNF-α等，均有很强的促炎作用，在炎症性疾病的发生发展中具有重要作用；而Treg分泌的IL-10是强效抑炎因子，是机体免疫耐受的重要保障。Th17与Treg相关效应因子的变化对炎症性疾病的发生发展及临床预后有较大影响。研究表明，他汀类药物能够改善心脑血管疾病患者的Th17/Treg细胞轴功能，采用瑞舒伐他汀治疗后，颈动脉粥样硬化患者血IL-17、IL-23、TNF-α等Th17相关效应因子水平显著降低，IL-10等Treg相关效应因子水平显著升高[11-12]。本研究结果显示，与对照组比较，虽然他汀组也有较为显著的变化，但联合组IL-17、IL-23、TNF-α水平降低和IL-10水平升高更明显。

LDL-C是血中胆固醇的主要携带者，血LDL-C水平升高可促进动脉粥样硬化，导致缺血性脑卒中的发生。LDL在缺血、缺氧条件下，经过氧化修饰，立体构象及生物活性发生改变，转变为ox-LDL。ox-LDL是缺血性脑卒中的独立危险因素，是评估脑卒中病情、预后和复发的重要指标。ox-LDL不但损害血管内皮功能，还具有很强的免疫原性，是炎症细胞浸润及激活的强效诱导剂，能够激活T细胞、巨噬细胞及白三烯，促进单核细胞趋化蛋白1、TNF-α、IL-6等炎症因子的释放[13-14]。研究表明，ox-LDL可促进Th17及Treg的增殖并分泌相应的细胞因子，产生体液及细胞免疫应答[15]。ox-LDL是导致缺血性脑卒中患者Th17/Treg细胞轴功能失衡的重要因素[8]。本研究结果显示，联合组ox-LDL治疗后较治疗前的下降幅度显著高于对照组和他汀组。相关分析也显示，血浆ox-LDL变化值与Th17比例、Th17/Treg、RORγt mRNA及血浆IL-17、IL-6、IL-23、TNF-α变化值呈负相关，与Treg比例、Foxp3 mRNA及血浆IL-10变化值呈正相关。提示他汀类药物与普罗布考联合应用能够更好地降低缺血性脑卒中患者的氧化应激反应，改善Th17/Treg细胞轴功能失衡。

综上所述，瑞舒伐他汀联合普罗布考能够协同作用，抑制氧化应激反应、减轻免疫炎症反应，对促进老年缺血性脑卒中患者康复具有重要作用。