紫癜性肾炎患儿血清BAFF、MK水平与肾损伤及Th17和调节性T细胞平衡的关系研究

谢宇飞，马彩霞，杨丽萍

复旦大学附属中山医院青浦分院儿科，上海 201700

紫癜性肾炎(Henoch schonlein purpura nephritis，HSPN)属于过敏性紫癜(Henoch schonlein purpura，HSP)患者较为严重的一种并发症，亦是临床发病率较高的一种继发性肾脏疾病[1]。若不及时给予治疗，则可能导致患者的肾脏产生明显的损伤，进而危及身体健康[2]，因此，早期准确诊断HSPN显得尤为重要，亦是提高临床治疗效果以及改善预后转归的关键。有研究报道表明[3]，B淋巴细胞活化因子(B lymphocyte activating factor，BAFF)介导多种自身免疫类病症的发生、发展过程，但关于其是否介导了HSPN的发生、发展以及免疫功能调节过程的研究并不多见。中期因子(Midkine，MK)主要表达于血管内皮细胞，亦可表达于部分器官黏膜上皮细胞中，在正常生理状态下微量表达，而在病理条件下可能出现高表达，可能具有促进炎症因子释放、刺激血管生产以及促进肿瘤进展等作用[4]。Th17细胞是近年来免疫学研究的热点，其和调节性T细胞之间的平衡被打破是目前临床上公认的自身免疫性疾病发生的关键[5]。鉴于此，本文通过研究HSPN患儿血清BAFF、MK水平与肾损伤及Th17和调节性T细胞平衡的关系，旨在为临床HSPN的诊治提供新的靶点与思路，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 将复旦大学附属中山医院青浦分院儿科2017年1月至2020年1月收治的71例HSPN患儿作为研究组。其中男性37例，女性34例；年龄4～11岁，平均(7.42±1.34)岁。另取同期我院收治的70例HSP患儿作为HSP组，其中男性38例，女性32例；年龄4～12岁，平均(7.51±1.31)岁。纳入标准：(1)HSP患儿均符合《儿童过敏性紫癜循证诊治建议》[6]中的有关诊断标准；(2)HSPN患儿均符合《紫癜性肾炎诊治循证指南》[7]中的有关诊断标准；(3)纳入研究前尚未接受相关治疗；(4)患儿家长或其监护人知情同意。排除标准：(1)其他原发或是继发型肾脏类疾病者；(2)合并感染性疾病，免疫功能异常者；(3)研究前1个月已实施免疫抑制剂或是糖皮质激素类药物治疗者。另选取同期于我院体检的70例健康志愿儿童作为对照组。其中男性35例，女性35例；年龄4～11岁，平均(7.47±1.35)岁。三组受检者的性别和年龄比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经我院伦理委员会批准。

1.2 检测方法 (1)血清BAFF、MK水平：分别于清晨空腹状态下采集所有受试者的静脉血6 mL，2 330 r/min离心10 min处理，获取血清分成两份置于冰箱中保存备用，其中一份采用酶联免疫吸附法检测血清BAFF、MK水平，操作严格按照试剂盒(分别购自美国R&D公司以及eBioscience公司)说明书完成。(2)肾损伤指标：采用7060型全自动生化分析仪检测肾损伤指标，包括尿微量白蛋白、尿转铁蛋白、尿β微球蛋白、尿素氮以及肌酐，具体操作遵循仪器说明书进行。(3)Th17细胞比例：首先采集血液样本，以肝素锂进行抗凝，同时予以RPM1 1640稀释，加入20μL的离子霉素、25μL的PMA、4μL的佛波酯，置于37℃条件下进行时长为240～360 min的孵育。随后将其均匀分作两管，一管加入CD3-PerCP，另一管加入CD8-FITC，室温条件下予以15 min的孵育，加入100μL的固定液，室温下避光静置15 min。随后分别于两管中加入IgG1-PE以及IL-17-PE，室温条件下静置15 min。采用磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer，PBS)洗涤、重悬后以流式细胞仪完成检测。(4)调节性T细胞比例：通过Ficoll分离液采集外周血PBMCs，调节细胞数至1×106/mL，加入10μL的CD4-FTTC以及CD25-APC抗体，放置在4℃条件下进行时长为20min的孵育，采用PBS洗涤，并加入400μL的固定/穿膜液，放置在室温条件下静置40 min。再经PBS洗涤，加入800μL的缓冲液，放置在室温条件下静置20 min。重悬处理后均匀分作两管，一管加入F0XO3-PE抗体，另一管加入对照抗体，放置在室温条件下孵育30 min，经PBS洗涤及重悬之后通过流式细胞仪完成测定。(5)Th17细胞相关因子水平：另一份血清样本采用酶联免疫吸附法检测白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)以及白细胞介素-17(Interleukin-17，IL-17)水平，上述操作遵循试剂盒(购自深圳晶美生物科技有限公司)说明书完成。

1.3 观察指标 比较三组受试者的血清BAFF、MK水平，肾损伤相关指标，Th17和调节性T细胞比例以及Th17细胞相关因子水平，分析血清BAFF、MK水平与肾损伤及Th17和调节性T细胞平衡的相关性。

1.4 统计学方法 应用SPSS22.0软件进行数据统计分析，计量资料呈正态分布，均数±标准差(±s)表示，两两比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，计数资料比较采用χ2检验。血清BAFF、MK水平与肾损伤及Th17和调节性T细胞平衡的关系采用Pearson相关性分析。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组受检者的血清BAFF、MK水平比较 研究组患儿的血清BAFF水平明显低于HSP组和对照组，而血清MK水平明显高于HSP组和对照组，其中HSP组患儿的血清MK水平明显高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，但HSP组患儿的血清BAFF水平与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 三组受检者的血清BAFF、MK水平比较(±s)

表1 三组受检者的血清BAFF、MK水平比较(±s)

注：与对照组比较，a P<0.05；与HSP组比较，b P<0.05。

组别研究组HSP组对照组F值P值例数71 70 70 BAFF(μg/L)0.65±0.20ab 1.27±0.44 1.28±0.45 16.203 0.001 MK(pg/mL)314.22±80.14ab 176.12±48.91a 101.32±40.36 20.585 0.001

2.2 三组受检者的肾损伤指标水平比较 研究组患儿的尿微量白蛋白、尿转铁蛋白及尿β微球蛋白水平明显高于HSP组和对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，而HSP组患儿的尿微量白蛋白、尿转铁蛋白及尿β微球蛋白水平分别与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。三组受检者的尿素氮及肌酐水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 三组受检者的肾损伤指标水平比较(±s)

表2 三组受检者的肾损伤指标水平比较(±s)

注：与对照组比较，a P<0.05；与HSP组比较，b P<0.05。

组别研究组HSP组对照组F值P值例数71 70 70尿微量白蛋白(mg/dL)17.37±3.25ab 0.78±0.21 0.72±0.25 22.195 0.001尿转铁蛋白(mg/dL)1.27±0.34ab 0.18±0.05 0.17±0.02 22.451 0.001尿β微球蛋白(mg/L)0.45±0.08ab 0.22±0.03 0.21±0.04 21.344 0.001尿素氮(μmol/L)3.71±0.68 3.72±0.69 3.66±0.52 1.305 0.734肌酐(mmol/L)30.42±7.33 29.45±7.05 28.47±7.11 1.592 0.721

2.3 三组受检者的Th17和调节性T细胞比例及血清IL-6、IL-17水平比较 研究组患儿的Th17细胞比例及血清IL-6、IL-17水平明显高于HSP组，而调节性T细胞比例明显低于HSP组，且HSP组Th17细胞比例及血清IL-6、IL-17水平明显高于对照组，而调节性T细胞比例明显低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 三组受检者Th17和调节性T细胞比例及血清IL-6、IL-17水平比较(±s)

表3 三组受检者Th17和调节性T细胞比例及血清IL-6、IL-17水平比较(±s)

注：与对照组比较，a P<0.05；与HSP组比较，b P<0.05。

组别研究组HSP组对照组F值P值例数71 70 70 Th17细胞比例(%)1.56±0.35ab 0.68±0.14a 0.52±0.11 25.233 0.001调节性T细胞比例(%)2.51±0.52ab 6.31±1.37a 7.91±1.44 17.195 0.001 IL-6(pg/mL)21.45±5.11ab 14.72±3.10a 10.44±2.09 12.290 0.001 IL-17(ng/L)91.56±20.15ab 45.10±14.56a 20.62±3.92 14.106 0.001

2.4 血清BAFF、MK水平与肾损伤及Th17和调节性T细胞平衡的相关性 经Pearson相关性分析显示：血清BAFF与Th17细胞比例、尿微量白蛋白、尿转铁蛋白、尿β微球蛋白及血清IL-6、IL-17均呈负相关(P<0.05)，与调节性T细胞比例呈正相关(P<0.05)；血清MK与Th17细胞比例、尿微量白蛋白、尿转铁蛋白、尿β微球蛋白及血清IL-6、IL-17均呈正相关(P<0.05)，与调节性T细胞比例呈负相关(P<0.05)，见表4。

表4 血清BAFF、MK水平与肾损伤及Th17和调节性T细胞平衡的相关性

3 讨论

HSP作为一种全身性小血管炎，关于其发病机制迄今尚未完全阐明[8-9]。相关研究报道指出，HSP作为变态反应性疾病之一，全身发生持续的微炎症状况是导致症状反复及肾脏受损的关键性原因，而患儿的长期预后受肾脏受累的直接影响[10-11]。HSPN作为HSP的一种严重并发症，其具体发病机制仍存在一定的争议，目前普遍认为可能和体液免疫以及细胞免疫功能紊乱等密切相关[12]。

BAFF在B淋巴细胞成活以及成熟过程中个发挥着至关重要的作用，主要表达于髓系细胞，在机体自身的免疫类疾病中的有关作用已广受关注，已有研究报道证实多种肾脏疾病患者的血清BAFF水平存在显著改变，可能参与疾病的形成及发展进程[13-14]。此外，MK介导了多类疾病的形成，可通过调控Th1细胞分化以及Treg细胞分化等途径发挥促炎作用，于急慢性肾脏疾病中的表达明显升高，值得临床重点关注[15]。此外，相关研究报道证实[16]，HSP患儿存在不同程度的Th17和调节性T细胞失衡，即Th17细胞水平升高，调节性T细胞水平下降，且两者比例失衡程度和疾病以及肾脏损害程度高度相关。由此推测，上述相关指标可能在HSP以及HSPH的发生、发展过程中起着至关重要的作用，通过探讨其临床意义，可为疾病的诊治提供参考依据。

本研究发现，HSPN患儿血清BAFF存在异常低表达，而MK存在异常高表达。考虑原因可能是BAFF主要功能在于调节B淋巴细胞的大小以及功能，刺激B淋巴细胞存活、增殖抗原呈递等，间接参与了机体免疫反应。其中HSPN患者体内的BAFF受体存在明显的表达增加，在和其受体特异性结合后，会引起血循环中的游离BAFF水平下降。MK既具有促血管形成以及加速内皮细胞增殖的重要作用，同时可发挥一定的刺激IL-17以及IFN-γ合成、分泌的作用，继而起到促炎的目的，因此其水平的升高往往预示机体炎症反应的加剧，故此，在HSPN患儿血清中存在明显高表达[17]。

有研究表明，尿微量白蛋白、尿转铁蛋白以及尿β微球蛋白等指标能够有效地反映出人体肾功能的有关状态，已被广泛地应用于临床监测过程中[18]。本研究显示，研究组尿微量白蛋白、尿转铁蛋白以及尿β微球蛋白水平均高于HSP组及对照组，而HSP组与对照组上述指标比较无明显差异，这提示了研究组患儿的肾功能存在较为明显地损害，原因主要考虑与HSPN患儿的肾炎病情处于较为强烈的进展状态等因素有关，而这将从肾功能相关监测指标中得到明显地反馈，因此上述三项指标的含量水平明显升高。

此外，HSPN患儿存在明显Th17和调节性T细胞失衡。过度活化的Th17细胞可通过大量合成、分泌IL-17以及IL-6等多种促炎细胞因子，诱导巨噬细胞、上皮细胞以及内皮细胞形成多类细胞因子以及趋化因子，从而致使炎症反应被放大，引起血管的炎症性损伤，介导了HSPN的发生、发展过程。调节性T细胞存在明显的免疫抑制效果，其可经由多个差异性的环节有效抑制各类效应T细胞的自主活化、增殖以及效应，继而维持自身免疫耐受，但其水平降低时可能提升B细胞数量和活力，进一步促进免疫球蛋白的分泌，从而诱导大量的免疫复合物在肾小球的有关毛细血管壁亦或是基底膜中发生沉积，最终引起肾脏免疫损伤[5]。进一步研究表明，血清BAFF、MK水平与肾损伤及Th17和调节性T细胞平衡存在密切相关。究其原因可能是随着血清BAFF水平的降低以及MK水平的升高，使患儿病情不断加重，肾脏损伤程度无疑随之增加，最终引起各项肾功能指标水平发生对应改变。同时，BAFF、MK可能经由抑制机体内调节性T细胞的有关途径，提升了Th17和调节型T细胞二者失衡的风险，间接介导HSPN的发生。

综上所述，HSPN患儿血清BAFF过低表达，而MK过高表达，两者可能是通过调控Th17和调节性T细胞平衡状态间接参与HSPN的发生。