细胞自噬在肠缺血性损伤中的作用*

李中华 综述 赵自刚审校

细胞自噬(Autophagy)广泛发生于真核细胞，是一种将细胞质成分、受损细胞器或感染因子运输到溶酶体进行降解的高度保守的分解代谢过程。当机体发生饥饿、生长因子缺乏或高能量需求时，自噬激活可以补充代谢所需能量，以及应对多种应激如缺氧、感染等[1, 2]。基础水平的自噬，通过清除应激、衰老和疾病过程中产生的多泛素化蛋白聚集体，降解入侵病原体，调节细胞因子的释放并参与抗原提呈和淋巴细胞发育，有利于维持细胞稳态[3]。肠缺血常继发于小肠移植和腹主动脉瘤等手术过程中，也是失血性休克、感染性休克等危重病理过程引起肠道应激性缺血、恢复再灌的常见病理生理过程。及时恢复肠道血液灌注，避免肠缺血性损伤、肠屏障功能障碍和肠源性细菌、内毒素移位，对防止全身炎症反应综合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome，SIRS)、远隔器官功能障碍与结构损伤，甚至多器官功能障碍综合征或多器官衰竭的发生至关重要。近年来，自噬在肠缺血性损伤中的作用日益受到关注，但具体作用仍存在争议。有研究报道自噬激活有助于减轻肠缺血性损伤，但也有研究发现抑制自噬有助于减轻肠黏膜屏障损伤[4, 5]。靶向自噬可能成为防治肠缺血性损伤的一种有效策略。

1 自噬在维持肠道稳态中的作用

1.1 自噬方式与过程

根据运输方式和生理功能，自噬主要分为三种：巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬，其中巨自噬即为我们通常所说的自噬，它是一种通过双层膜结合囊泡(即自噬体)吞噬待降解物质后，与溶酶体融合降解的方式[6]。自噬一般包括启动、成核、伸长、融合和降解等环节，主要受自噬相关基因(Autophagy-related Gene，ATG)的调节。自噬的启动由unc-51样激酶1(Unc-51 Like Kinase 1，ULK1)复合物[由ULK1、ATG13、200kDa的家族相互作用蛋白(Family Interacting Protein of 200kDa, FIP200)和ATG101等构成]激活。成核和伸长则由ULK1复合物诱导III类磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol 3-Kinase，PI3K)复合物(由Beclin1、ATG14、液泡蛋白分选蛋白[Vacuolar Sorting Protein，Vps)15、Vps34、III类PI3K等组成]完成[7]，III 类 PI3K将磷脂酰肌醇转化为磷脂酰肌醇-3-磷酸(Phosphatidylinositol 3-Phosphate，PI3P)，PI3P招募下游自噬相关蛋白进行膜的伸长；随后ATG5-ATG12-ATG16L1复合物以及ATG7和ATG3诱导微管相关蛋白轻链3(Microtubule-associated Protein Light Chain 3，LC3)由可溶解形式(LC3-I)转变为脂溶形式(LC3-II)，LC3-II与自噬泡的内膜和外膜结合成自噬体。之后的融合与降解过程为自噬体在Ras相关GTP结合蛋白7(Ras-related In Brain 7， Rab7)、突触结合蛋白17(Synaptotagmin-17，syt-17)、膜泡关联膜蛋白8(Vesicle Associated Membrane Protein-8，VAMP8)和溶酶体相关膜蛋白2(Lysosomal Associated Membrane Protein 2, LAMP2)等的介导下，与溶酶体融合成自噬溶酶体，分泌溶酶体酸性水解酶，降解其内容物并释放到细胞质中，完成自噬[8]。

1.2 肠黏膜屏障和自噬

肠黏膜屏障由黏液层、肠上皮细胞(Intestinal Epithelial Cells，IECs)以及黏膜下炎症细胞和免疫细胞层所构成，其动态平衡对于肠道内环境稳定至关重要。黏液层包含多种蛋白质、碳水化合物和脂类物质，其作用是避免上皮细胞直接接触肠道微生物。黏膜下层的炎症细胞和免疫细胞如巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等，可通过胞吞、抗原呈递、分泌细胞因子等方式触发自我防御，抵抗病原体入侵。IECs是由位于肠道黏膜Lieberkühn隐窝的肠道干细胞(Intestinal Stem Cells，ISCs)逐步分化而来，包括吸收性肠细胞和各种类型的分泌细胞如Paneth细胞、杯状细胞等。生理状态下IECs增殖与凋亡趋于平衡，以维持肠黏膜屏障的完整性和内环境稳定，正常发挥营养吸收和分泌黏液及功能蛋白的作用。研究表明，自噬可调控IECs的发育，进而调节其数量[9]。自噬在ISCs中呈区域限制性分布，一般在黏膜中含有增殖性的前体细胞或干细胞区域，且与ISCs存活相关。自噬缺陷的ISCs在衰老过程中更易发生DNA损伤、细胞周期阻滞和凋亡，使其数量显著减少[10, 11]。

吸收性肠细胞具有运输水、营养物质和离子、抵御病原体侵入和有毒物质泄漏、调节共生微生物群丰度和免疫反应等作用。肠细胞的自噬激活可有效抑制大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、粪肠球菌和福氏志贺菌等的复制、侵袭和播散；还可以通过靶向降解肠细胞间紧密连接(Tight Junction，TJ)的孔隙通道蛋白Claudin-2，使细胞旁通透降低，从而增强肠细胞间TJ屏障功能。但有研究发现肠细胞的自噬激活可能降低跨上皮细胞电阻，使细胞旁通透性增强，并破坏闭锁小带蛋白1(Zonula Occludens-1，ZO-1)和闭锁蛋白(Occludin)，降低肠屏障功能[12]；还有研究报道鼠伤寒沙门菌可能利用自噬来促进其在细胞内增殖[13]，反映出自噬在吸收性肠细胞的作用存在争议，需进一步深入验证。

具有分泌功能的Paneth细胞能够储存并分泌抗微生物肽(Antimicrobial Peptides，AMP)如溶菌酶、防御素、抗菌肽及隐蛋白等，用于生产抗菌材料，保护并增强ISCs功能。自噬是Paneth细胞发挥上述功能的重要调节因子，主要参与并调节Paneth细胞分泌颗粒的形成及功能。自噬受损可能导致AMP减少，引起肠道生态失调，自噬相关基因ATG16L1、ATG4B、ATG5、ATG7缺失会导致Paneth细胞相关功能的丧失[14]。Paneth细胞一系列分泌途径中，分泌性自噬途径可以抵御入侵细菌，因其在Paneth细胞分泌溶菌酶过程中起重要作用[15]。

杯状细胞也是一种分泌细胞，可产生多种黏蛋白如Muc2、Muc5AC和Muc6等，这些黏蛋白经过交联形成肠黏膜屏障的黏膜层，具有防止Toll样受体过度活化，抵御入侵微生物，保护IECs的作用[14]。已有研究表明了自噬调控杯状细胞分泌黏蛋白的作用机制与活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)有关， ROS可参与自噬蛋白 LC3 启动杯状细胞黏蛋白颗粒的积聚和分泌，但当自噬基因缺失(如ATG5、ATG7和LC3)时，内质网ROS的增加可能减少黏蛋白的产生[16]。

1.3 自噬与肠道炎症反应

越来越多的研究表明，肠道菌群紊乱与肠道炎症性疾病密切相关。自噬相关基因ATG16L1缺失会导致肠道菌群失调和肠道炎症的发生[17], ATG16L1突变小鼠在感染鼠伤寒杆菌后不能通过Paneth细胞的分泌性自噬途径分泌溶菌酶，也会导致肠道菌群失调，这或许是克罗恩病的原因[18]；将ATG16L1 T316A(相当于人体T300A)敲入小鼠的巨噬细胞中可使ATG16L1蛋白表达显著减少、自噬功能减低和促炎细胞因子IL-1β表达增加，使其更易于发生肠道炎症[7]。此外，免疫相关GTP酶M蛋白(Immunity-related GTPase Family M Protein，IRGM)、酸结合寡聚化结构域(Nucleotide-Binding Oligomerization Domain 2，NOD2)和富含亮氨酸的重复激酶2(Leucine-rich Repeat Kinase-2，LRRK2)等自噬相关基因的功能障碍也能导致肠道炎症[7]。IRGM 的多态性可致实验动物自噬功能失调，使肠道炎性反应持续存在。NOD2被肠道细菌产物激活后，即招募ATG16L1至隔离膜上，形成自噬体。但当自噬被抑制，NOD2的刺激将会引起促炎细胞因子反应性增加。LRRK2与异源自噬(即自噬降解入侵微生物如细菌、病毒等的过程)和Paneth细胞的分泌性自噬相关，LRRK2 缺失可导致Paneth细胞的自噬功能受损，促使炎症性肠病发生[19]。

研究发现，自噬与肠道炎症之间的联系机制主要与炎症小体相关，自噬可以通过促进ROS生成、下调 IL-1β 前体而控制炎症小体的表达[7]。当自噬缺陷时，炎症小体活化，产生较多的促炎细胞因子，引起肠道炎症反应[20]。此外，自噬也通过调节共生细菌的免疫反应、调节黏液分泌和miRNA沉默通路等，阻止肠道炎症反应[21]。还有研究报道，肠上皮细胞的自噬缺陷可使肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)增加而引起肠细胞死亡，以及使肠道炎症敏感性增加[22]。

2 肠缺血激活自噬有助于改善肠道损伤

2.1 肠缺血的病变特点

肠缺血引起血管功能障碍有四种类型：栓塞性动脉闭塞(40%-50%)、血栓性动脉闭塞(20%-35%)、非闭塞性形式(5%-15%)和静脉肠系膜血栓形成(5%-15%)[23]。一般短时间和轻度缺血情况下，肠系膜血管可代偿性收缩以满足重要器官的血液灌注，而不会损害肠道系统。但当机体长时间或重度缺血时，这种血容量的重新分配则会导致严重的肠道缺血，引起一定程度的肠道损伤。肠缺血性损伤首先从对低灌注和对缺氧高度敏感的黏膜绒毛开始，表现为绒毛断裂和出血。一旦肠黏膜屏障完整性破坏，可能迅速引起炎症介质的聚集和细菌内毒素及其它微生物成分进入血液，引发局部和全身炎症反应，甚至引起SIRS，加剧肠道灌注不足和损伤[24]。有效液体复苏可以逆转缺血状态，避免肠组织的不可逆坏死，但液体再灌注可能造成ROS的产生，并超出局部组织的清除能力，使自由基扩散到周围区域，引发恶性炎症循环。炎性细胞因子进入体循环，还可能引起远端器官如肝和肺的炎症损伤[25]。

2.2 肠缺血激活自噬及分子机制

近年来，人们越来越关注肠缺血性损伤与自噬之间的相互联系。许多研究结果表明肠缺血损伤后，与自噬体形成密切相关的LC3-II/LC3-I比值升高，与自噬活性呈负相关的p62表达下调，电镜检查自噬体数目明显增多[26-28]，都充分佐证了肠缺血损伤后自噬增强。自噬的激活因子是磷酸腺苷依赖的蛋白激酶(Adenosine 5'-Monophosphate-Activated Protein Kinase，AMPK)。在缺血的初始阶段，肠上皮细胞的低ATP水平激活AMPK，然后经过直接或间接的ULK1作用来调控自噬的发生。位于AMPK上游的两个激酶，钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶2(Recombinant Calcium/Calmodulin Dependent Protein Kinase Kinase 2，CAMKK2)和肿瘤抑制因子肝激酶B1(Liver Kinase B1，LKB1)，主要负责调控AMPK亚单位的磷酸化；肠缺血性损伤过程中能量耗竭激活AMPK有赖于LKB1，细胞内钙超载激活AMPK依赖于CAMKK2[29]。有研究者观察到芍药苷可使肠缺血再灌注损伤大鼠p-LKB1与p-AMPK表达同步增加，而p-CAMKK2则无明显变化[27]，揭示LKB1/AMPK可能是肠缺血自噬激活的重要信号通路。

2.3 自噬对肠道损伤的改善作用

研究表明自噬激活有助于减轻肠缺血性损伤。ATG4B对miR-665-3p抑制介导的肠保护起到关键作用，可能是自噬激活改善肠缺血性损伤的关键靶点。miR-665-3p抑制可以刺激自噬活性，降低血液TNF-α和IL-6水平，抑制NOD样受体家族3(Nucleotide Binding Oligomerization Domain-like Receptors，NLRP3)炎症小体表达和IL-1β成熟，并阻碍Caspase-3的激活，减轻炎症和凋亡，有助于改善肠缺血性损伤。芍药苷预处理对大鼠肠缺血再灌注损伤保护机制可能是通过增加肠道缺血损伤的自噬通量，减轻肠道炎症、氧化应激和细胞凋亡来实现的[27]。核因子E2相关因子(Nuclear Factor E2 Related Factors，Nrf2)改善肠缺血性损伤作用通过AKT/糖原合成酶激酶-3β(Gglycogensynthesis Kinase-3β，GSK-3β)信号通路激活自噬，减少氧化应激，改善肠缺血性损伤[30]。自噬还可显著抑制NLRP3炎症小体活化[28]，改善肠缺血性损伤，降低放射性和烧伤性因素引起肠缺血时的ROS与自由基水平升高，减少氧化应激，减轻肠道损伤[31]。

3 抑制过度自噬有利于减轻肠道损伤

研究显示，肠缺血性损伤可能引起自噬的过度激活，而抑制过度自噬有助于减轻肠损伤[4, 32]。Li等[26]在一项肠缺血再灌注实验研究中发现，缺血前给予自噬激活剂雷帕霉素大鼠肠损伤加重，而在肠缺血前给予自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)大鼠肠损伤明显减轻，两者肠损伤程度与其自噬水平变化呈正相关关系，亦即自噬过度加剧肠损伤，抑制过度自噬可以减轻肠损伤。El-Malkey等[5]也报道了相同结果，而且认为这种过量的自噬表达可以用氧化应激反应来解释，ROS诱导的Beclin-1和LC3增加可能是过度自噬的主要原因。Beclin 1和LC3是自噬的中心调节蛋白， Beclin-1过表达不仅提升LC3-II水平，促进自噬体形成，而且抑制自噬体清除[33]。

过度自噬可能与一些触发因素如ROS爆发、线粒体Ca2+超载、氧化应激及炎症反应等等有关[27]。这些因素可以通过激活Bcl-2腺病毒E1B 19kDa相关蛋白3(Bcl-2/Adenovirus E1B 19kDa Interacting Protein 3，BNIP3)，引起线粒体膜通透性转换孔(Mitochondrial Permeability Transition Pore，mPTP)开放增加，促使自噬过度表达[34]。另外ROS 水平升高，不仅导致 Beclin-1过表达，增加自噬流量[35]，还使ATG4发生氧化，使其活性降低，促进LC3脂质化，从而增强自噬激活[36]。

自噬是一个动态过程，在缺血性疾病中起有益还是有害作用取决于机体氧供的改变、损伤的程度以及不同器官对缺血的耐受性[37]。适度自噬有利于细胞在各种应激条件下存活，而自噬过度或自噬不足可引发肠道炎症、ROS积累等，导致肠黏膜屏障损伤。而将自噬维持在一个适当的水平，对保护肠道生理功能和抵御各种病理侵害都具有积极意义。

4 小 结

自噬通过调节肠上皮细胞的功能和调控肠道细菌炎症反应，维持了肠粘膜屏障耐受性和防御性之间的平衡。肠缺血可能通过AMPK对ULK1的直接或间接作用激活自噬，自噬激活则能减轻炎症反应、降低氧化应激水平，从而改善肠道损伤。肠缺血性损伤与再灌注会引发过度自噬而加剧肠损伤，抑制由ROS爆发诱导的Beclin-1和LC3过高表达可能逆转其负效应。因此，针对肠缺血性损伤时自噬表达水平及其多重作用，研究如何能够维持适度自噬，避免过度与不足，将是今后工作的重点，也将对未来利用细胞自噬治疗或预防肠缺血性损伤提供新理论和新方法。

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