白细胞介素-8、白细胞介素-15水平与毛细支气管炎患儿严重程度的关系*

刘丽颖 司永华 高 阳 刘兴岳 刘宝环

呼吸道合胞病毒(RSV)是毛细支气管炎的常见病因。RSV感染的临床表现可以从普通上呼吸道感染进展到需要机械通气的严重下呼吸道感染。约1%-2%的RSV感染患儿需要住院治疗，其中6%-11%患儿需要重症监护。年龄偏小、早产、RSV感染和并发症是其发展成为重症的危险因素[1]，对婴幼儿的健康造成严重威胁。据统计，毛细支气管炎患儿日后发展为哮喘的概率高达29.1%-40.9%[2]，但至今尚不清楚具体的作用机制。自然杀伤(NK)细胞是先天性淋巴细胞，在对抗感染时作为“第一反应者”[3]，这种快速反应能力在RSV感染中的重要性不言而喻。NK细胞也会形成随后的适应性免疫反应。白介素家族(ILS)共享一个共同的γ链受体(γc)，通过增加bcl-2和bcl-xl抗凋亡蛋白的表达可以调节淋巴细胞的稳态，尤其对NK细胞稳态调节起着重要作用。白细胞介素-8(IL-8)及白细胞介素-15(IL-15)可以调控NK细胞的发育和活化状态[4，5]。因此，理论上IL-8和IL-15水平变化在RSV致毛细支气管炎的疾病进展中起重要作用。但目前关于IL-8、IL-15与毛细支气管炎病情发展的相关性研究鲜有报道。因此，本文通过检测患儿血清IL-8和IL-15的水平变化，探讨其与病情严重程度的相关性，为临床诊断和治疗提供一定的思路。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取本院在2016-01-2018-01期间入院治疗的RSV毛细支气管炎患儿。纳入标准：鼻咽分泌物经聚合酶链式反应(PCR)证实为RSV感染，临床表现：流涕、咳嗽、阵发性喘息、气促、胸壁吸气性凹陷(三凹征)、听诊呼气相延长、可闻及哮鸣音及细湿啰音；年龄<2岁。排除标准：其它呼吸系统疾病、免疫缺陷史、先天性心脏病、血液动力学不稳定、有死亡危险或缺乏父母监护患儿；既往3个月内使用支气管舒张剂、类固醇治疗患儿。最终纳入患儿100例(疾病组)。年龄3.8-5.7月，平均年龄(4.83±0.35)月；男62例，女38例；体重2.85-5.35kg，平均体重(3.27±1.77)kg；早产儿13例；特应性疾病家族史57例；出现症状时间4-7天，平均时间(5.53±0.78)天。同期严格遵循随机原则招募21例体检正常的儿童进行对照研究，年龄3.9-5.4月，平均年龄(4.86±0.37)月；男8例，女13例；体重3.05-5.22kg，平均体重(3.09±1.33)kg。两组对象性别、年龄、体重差异无统计学意义(χ2=2.983，t=0.197，0.518，P均>0.05)，具有可比性。本次研究经我院医院伦理委员会批准且入组儿童监护人均签署知情同意书。

1.2 疾病组患儿分组

根据毛细支气管炎诊断、治疗与预防专家共识(2014年版)[6]，疾病组患儿被分为3组。轻度组(35例)：喂养量正常，呼吸频率正常或稍增快，轻度胸壁吸气性三凹征，无鼻翼煽动或呻吟，血氧饱和度>92%；精神状态正常。中度组(41例)：喂养量下降至正常一半，呼吸频率>60次/min，中度胸壁吸气性三凹征，无鼻翼煽动或呻吟，血氧饱和度88%-92%；轻微或间断烦躁、易激惹。重度组(24例)：喂养量下降至正常一半以上或拒食，呼吸频率>70次/min，重度胸壁吸气性三凹征，出现鼻翼煽动或呻吟，血氧饱和度<88%，极度烦躁不安、嗜睡、昏迷。

1.3 一般资料收集

收集入组儿童年龄、性别、体重、早产史、特应性疾病家族史、症状时间。入组患者的血液样品均在入院后第2天收集。

1.4 血液指标检测

1.4.1 血清IL-8、IL-15水平检测：采集入组患儿及对照组血液3ml, 4℃、3 000r/min离心15min，取上清后采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测IL-8、IL-15水平(购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司酶联免疫试剂盒)。

1.4.2 外周血单核细胞(PBMC)IL-8 mRNA、IL-15 mRNA水平检测：采集入组患儿及对照组外周静脉血EDTA抗凝，采用密度梯度离心法提取PBMC，实时荧光定量PCR (qPCR)方法检测外周血单核细胞中IL-8 mRNA及IL-15 mRNA水平(PCR试剂盒购自上海雅吉生物科技有限公司)。步骤如下：用TRIzol法提取总RNA，以逆转录试剂合成方法合成 cDNA。 以cDNA 为模板，加入特异性引物，具体如下： 2×SYBR Premix Ex TaqⅡ(10μl)、ROX DYEⅡ(0.4μl)、上下游引物(各0.4μl)、cDNA(2μl)、ddH2O(6.8μl)，总体积20μl。扩增条件：94℃预变性3min, 94℃变性30s， 62℃复性45s，60℃延伸60s，共45个循环。用2-△△Ct法，以β-actin表达为内参定量IL-15 mRNA及IL-8 mRNA的相对表达量。

1.5 小儿危重病例评分法(PCIS)评分[7]

评定标准：包括心率、血压、呼吸、动脉血氧分压(PaO2)、pH值、血钠、血钾、肌酐(Cr)或血尿素氮(BUN)、血红蛋白(Hb)、胃肠系统，每项均采用3级评分法，分值为4分、6分和10分，其中Cr与BUN评分时计1项，分值范围40-100分，≤70分为极危重症，71-80分为危重症，>80分为非重症。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 各组PBMC中IL-8 mRNA、IL-15 mRNA水平比较

各组PBMC中IL-8 mRNA、IL-15 mRNA水平差异有统计学意义(P<0.01)。轻度、中度、重度各组患儿的IL-8 mRNA、IL-15 mRNA水平均高于对照组(t均>86.51，P<0.01)；与轻度组比较，中度组和重度组患儿的IL-8 mRNA和IL-15 mRNA表达水平均升高，(t均>45.42，P<0.01)；与中度组比较，重度组患儿的IL-8 mRNA和IL-15 mRNA表达水平降低(t=22.82，P<0.01)，见表1。

表1 各组IL-8 mRNA、IL-15 mRNA水平比较

2.2 各组血清IL-8和IL-15水平比较

各组血清IL-8、IL-15水平差异有统计学意义(P<0.01)。轻度、中度、重度各组患儿血清IL-8、IL-15水平均高于对照组(t均>20.44，P<0.01)；与轻度组比较，中度组和重度组患儿血清IL-8和IL-15水平均升高(t均>19.50，P<0.01)；与中度组比较，重度组患儿血清IL-8和IL-15水平亦升高(t均>17.52，P<0.01)。见表2。

表2 各组血清IL-8、IL-15水平比较

2.3 不同病情严重程度患儿PCIS评分比较

各组患儿PCIS评分差异有统计学意义(P<0.01)。重度组患儿PCIS评分高于轻度和中度组(t均>35.70，P<0.01)；中度组患儿PCIS评分高于轻度组患儿(t=15.34，P<0.01)，见表3。

表3 不同病情严重程度患儿PCIS评分比较

2.4 血清IL-8和IL-15水平与患儿疾病严重程度的相关性分析

疾病组患儿血清IL-8和IL-15水平与PCIS评分呈正相关(r= 0.842、0.952，P<0.05)，见图1。

图1 IL-15及IL-8水平与患儿病情严重程度的相关性分析

3 讨 论

毛细支气管炎主要由病毒感染引起，其中RSV和鼻病毒是最常见的病原[8]。毛细支气管炎可能导致患儿日后出现反复喘息甚至发生哮喘[9]，研究表明[10]：RSV感染可导致气道上皮细胞肿胀，继而坏死和脱落，同时释放大量的炎性因子，发生一系列的免疫和病理反应，导致气道上皮结构破坏和功能缺陷，引起反复喘息，甚至可能导致日后哮喘的发生。

本研究通过检测患儿血清IL-15及IL-8水平变化，探讨其与毛细支气管炎患儿疾病严重程度的关系。以期能够为该病患儿的临床治疗节约时间，降低其日后发生哮喘的概率。

毛细支气管炎患儿PBMC中IL-15 mRNA及IL-8 mRNA表达上调，血清IL-15及IL-8水平升高。这与RSV感染引起的先天免疫反应过程一致。随着疾病严重程度增加，血清IL-15及IL-8水平升高；但是未观察到重度组患儿的IL-15 mRNA及IL-8 mRNA表达持续上调。重度毛细支气管炎患儿血清IL-15和IL-8水平与IL-15 mRNA和IL-8 mRNA表达变化缺乏一致性，可能有多种解释。首先，血清IL-15和IL-8水平反映了所有细胞产生的总和，而本研究中所检测的IL-15 mRNA及IL-8 mRNA表达仅反映了单核细胞中mRNA的表达。IL-15及IL-8表达在mRNA水平上可能受到严格的、精密的靶向调控。另外，重度组患儿IL-15 mRNA及IL-8 mRNA表达水平未持续上调可能是重度毛细支气管炎患儿出现“免疫麻痹”。在脓毒症状态持续存在的患者中，观察到宿主免疫反应从促炎转变为抗炎或免疫无反应状态而导致“免疫麻痹”现象出现[11]。在重症肺炎患者中同样也观察到类似 “免疫麻痹”现象[12]。在这种情况下，“免疫麻痹”可能是由基因介导的，且与部分患儿存在重度毛细支气管炎患儿的遗传易感性有关。这与相关研究[13-15]学者报道的结果一致。他们认为RSV感染严重程度部分由遗传因素决定。最后，重度毛细支气管炎患儿单核细胞中IL-15 mRNA及IL-8 mRNA表达水平未持续上调可能反映病毒致病作用。例如，RSV感染单核细胞和树突状细胞能降低其激活CD4+T细胞的能力。而IL-15及IL-8在单核细胞和树突状细胞中均存在表达[16]。IL-15是NK细胞的生长分化因子，它影响B淋巴细胞增殖和抗体产生。研究表明IL-15抑制嗜酸性粒细胞凋亡，通过Th细胞活性诱导IL-5合成，通过促进哮喘大鼠Th1型免疫应答抑制Th2型免疫应答[17]。此外，本研究相关性分析显示IL-8、IL-15与病情严重程度呈正相关的结果，提示病情越严重，IL-8、IL-15水平越高，IL-8与IL-15可能参与了毛细支气管炎发病的病理生理过程，并与病情程度有一定的关联。

综上所述，IL-15及IL-8可能参与RSV致毛细支气管炎患儿疾病进展，可作为病情诊断的参考指标，因本研究观察时间较短，还需未来进行长期的、大样本的研究，以便提供更准确的结论供临床参考。

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