去泛素化酶在喉癌及舌癌中的作用及机制研究

王洁 华清泉

喉鳞状细胞癌(LSCC)与舌鳞状细胞癌(TSCC)是发生于人体言语发声器官中较为常见的肿瘤，其致病因素十分复杂，包括烟草和酒精摄入、人乳头瘤病毒(HPV)或EB病毒(EBV)等病毒感染、辐射、牙周疾病、维生素缺乏症和饮食习惯(Pezzuto,2015)。在过去的十年中，经过分子和细胞遗传学研究证明，各种癌基因和抑癌基因的突变或异常表达促进了喉癌及舌癌的恶性表型，因此，分子水平的深入研究有利于喉癌及舌癌患者的合理治疗，为其治疗提供了新的思路和方法。

泛素-蛋白酶体系统是非溶酶体内源性蛋白质降解的主要途径，在真核细胞内蛋白质调控意义重大[1]。蛋白质的泛素化是一个动态平衡的过程，去泛素化是泛素化的逆过程，由去泛素化酶(DUBs)参与调控。有研究报道称，去泛素化酶可以通过去泛素化过程调节细胞周期相关蛋白，在维持细胞内蛋白质的稳定性方面发挥重要作用[2]，它还参与了细胞的生长、增殖和分化等。同时，去泛素化酶会导致多种人体疾病(如癌症、免疫性疾病)的发生，去泛素化酶已成为致癌基因和肿瘤抑制因子的重要调节剂，参与体内如细胞周期控制[3]、DNA修复[4]、染色质重塑[5]和信号传导途径[6]等直接或间接反应来影响许多癌症的发生及发展。另外，一些可以靶向作用于喉癌与舌癌的去泛素化酶抑制剂具有特异性强、细胞毒性弱等优势。本文对参与喉癌与舌癌发生发展的去泛素化酶及其发生机制进行综述，为其诊断、预后和治疗提供新的方向。

1 去泛素化酶的分类与结构

去泛素化酶可以在底物泛素化过程中的各个阶段起作用，包括底物多泛素链的加工，去除泛素底物，或去除残留的泛素分子以促进蛋白酶体降解和泛素蛋白的循环[7]。目前人类的蛋白酶可分为六个亚类，共100多位成员，其中五个为半胱氨酸蛋白酶，分别为泛素羧基末端水解酶家族(UCHs)、泛素特异性加工酶家族(USPs)、MJD结构域蛋白酶家族(MJDs)、卵巢肿瘤(OUT)相关蛋白酶(OTUs)和单核细胞趋化蛋白诱导的去泛素酶家族(MCPIPs)，Mpr1-Pad1氨基末端结构域(MPN)/JAMM结构相关蛋白酶家族(JAB1/MPN/Mov34s，JAMMs)为最后一个亚类，为含Zn2+的金属蛋白酶。USPs为其中最大的一类，大约有50多种[8]，USPs和UCHs是最具特征性的去泛素化酶。USPs家族的催化结构域分为手掌域(palm)、手指域(finger)和拇指域(thumb)三个子域，在palm与thumb之间具有催化中心，泛素分子可以被finger子域夹取而被去除，这三个子域在USPs家族中具有高度的保守性[9]。UCHs家族是巯基蛋白酶，对泛素化底物起修饰作用[10]，其催化核心由230个氨基酸组成，UCHs家族具有一个活性位点交叉环，泛素蛋白的C末端可以从中穿过而发生去泛素化反应(Johnston，1999)。去泛素化酶因从标签蛋白修剪泛素从而回收泛素单体，防止一些体内重要的抑癌蛋白如TP53等泛素化降解，从而有潜力成为一类抗癌靶标(Ciechanover，2000)。

2 去泛素化酶在喉癌与舌癌发生发展中的作用

2.1影响舌癌细胞与喉癌细胞的增殖与凋亡 细胞的周期调控、增殖失控、抑制凋亡都会影响肿瘤的发生发展。泛素特异性蛋白酶22(ubiquitin-specific protease 22，USP22)位于17号染色体，可通过组蛋白(H2A和H2B)去泛素化间接影响染色质结构，从而调节众多基因的转录活化并广泛影响生物学功能[11]。同时，USP22具有癌症干细胞的蛋白特征，可以促进形成侵袭性肿瘤生长的各种蛋白质[12]，因此，USP22是细胞周期调控的重要组成部分。在舌癌组织中降低USP22的表达可影响细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂CDKI/Rb信号通路，使P21和P27CDKI的表达水平升高，Rb蛋白的表达降低，从而抑制舌癌细胞增殖[13]。免疫组化实验发现USP22在喉癌组织中表达上调[14]，且与喉癌的恶性程度、侵袭转移及预后紧密相关。

泛素特异性蛋白酶9X(ubiquitin-specific protease 9X，USP9X)是USPs家族中的一员，它与胰腺癌、多发性骨髓瘤等肿瘤的发生发展有关[15]。在舌癌细胞中体外转染siUSP9X后，处于G0/G1期的细胞的百分比降低，而处于S和G2/M期的细胞百分比升高。USP9X在体外表达降低后，癌细胞增殖会不同程度的变慢，USP9X水平调控舌癌细胞增殖可以通过下游转录因子HES-1(Notch途径)[16]，USP9X也可能通过雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途径的PI3K/Akt信号通路调节舌癌的增殖[14，17]，但USP9X的缺失可能对肿瘤细胞生长有害，其在原发性肿瘤细胞中的丢失可能会加速继发性肿瘤的发展[18]。

泛素特异性蛋白酶14(ubiquitin-specific protease 14，USP14)是一种被证实与多种癌症的发生和发展有关的去泛素化酶。在肿瘤异种移植小鼠中，敲低USP14的舌癌相较对照组生长缓慢。在舌癌组织中，USP14的表达高于癌旁组织，体外实验发现敲低USP14的表达可以抑制舌癌细胞的增殖与迁移[19]，体内外实验结果一致表明USP14可以促进舌鳞癌的增殖与侵袭。USP14的抑制剂bA-125会引起泛素化蛋白的大量增加，触发肿瘤细胞的凋亡，激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase 3)以产生caspase 3与聚二磷酸腺苷核糖聚合酶PARP-1的剪切体，从而引起肿瘤细胞凋亡[20]。

泛素化蛋白酶4(ubiquitin-specific protease 4)是从靶蛋白上裂解泛素起到去泛素化的作用，参与了体内肿瘤形成的多种信号通路的调控(Chen,2002;Micheau,2003)。有文献报道USP4在舌癌中较癌旁组织的表达升高，免疫共沉淀实验发现USP4与受体相互作用蛋白1(RIPI)可相互作用，以去除RIPI K63连接的泛素分子稳定RIPI的表达，从而负调节RIPI泛素化介导的核因子κB(NF-κB)的活化及促进肿瘤坏死因子TNF-α诱导的凋亡(TNF是细胞凋亡的主要介质)，起到抑制舌癌细胞凋亡的作用[21]。

2.2去泛素化酶与喉癌及舌癌的预后 喉癌和舌癌的预后与其分期、复发及是否有淋巴结转移有关。泛素特异性肽酶7(ubiquitin-specific protease 7，USP7)是一种去泛素化酶，可参与细胞内的肿瘤调控、DNA修复、免疫应答和表观遗传效应[22]。在喉癌组织中，免疫组化显示USP7的表达升高与组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶(EZH2)相关[23]，EZH2可以促进体内上皮-间质转化(EMT)的表达，从而抑制细胞的衰老与分化[24]，EZH2在各种恶性肿瘤中高表达，包括鼻咽癌[25]。在低分化喉癌组织中USP7的表达高于高分化癌组织，且USP7的高表达与淋巴管浸润程度高(P<0.001)和TNM分期高(P<0.001)皆有明显的关系，生存分析发现USP7表达的增高与喉癌患者的生存期缩短有关。

泛素化蛋白酶2a(ubiquitin-specific protease 2a，USP2a)是USP2的两个剪接变体之一，调节体内多种重要的细胞生长和分化调节因子及信号转导因子的稳定性和功能(Graner，2004)。在舌癌组织中，USP2a升高与其预后不良、生存期缩短有关。ErbB2相互作用蛋白(Erbin)与USP2a在舌癌中的表达均上升，显示Erbin与USP2a的表达与淋巴结转移正相关，与吸烟也有显著正向关系；也有研究表明，在舌癌中，USP2a的表达与表皮生长因子(EGF)有关，其表达高于正常上皮，且与其临床病理特征有关[26]。

2.3对喉癌及舌癌放疗敏感性的影响 由于部分喉癌或舌癌患者发现时已是晚期，因此需要手术结合放疗的综合治疗来提高患者的生存率；放疗实施时需根据原发肿瘤部位、临床分期、术后病理诊断和术后影像学评估确定照射靶区和剂量，喉癌与舌癌对放疗的耐受性是影响其预后的主要因素。乳腺癌易感基因相互作用蛋白1(BRCA1，BAP1，又称UCHL2)为UCHs家族的去泛素化酶，可以调节多个细胞过程，包括细胞周期、细胞分化、转录、DNA损伤反应和抵抗肿瘤的放疗作用。BAP1的突变可以增加喉癌与舌癌细胞对于放疗的敏感性，导致肿瘤易感综合征，与体内的高危型人乳头瘤病毒(HPV)和p53抑癌蛋白的状态无关。研究发现,放疗后BAP1敲除的舌癌与喉癌细胞存活分数相比对照组显著降低，其对放疗的敏感性升高，并且这种敏感性可通过强制再表达而逆转[27]。BAP1可通过去泛素化组蛋白H2A增强其稳定性使其表达水平升高，从而干扰双链断裂处的染色质和组蛋白修饰，使细胞增殖速度降低以增加放疗的敏感性[28]。

2.4对喉癌与舌癌内免疫机制的影响 癌症被认为是一种免疫抑制性疾病，其特征在于免疫细胞功能失调和细胞因子排泄障碍[29]。EB病毒(EBV)与喉癌、舌癌的发生紧密相关[30,31]，去泛素化酶BPLF1是EBV内最大的蛋白质，在其它蛋白N端区域的前205个氨基酸中存在去泛素化酶活性，它的去泛素化活动可以裂解K63和K48多聚泛素链，这两种调节功能在防止病毒蛋白质降解中发挥作用[32]。BPLF1敲除的EBV病毒，其基因组的复制量及传染性降低。EBV的BPLF1蛋白及其保守的去泛素化活性调节细胞DNA修复酶聚合酶并将其募集到潜在的病毒破坏和复制位点，从而增强生产出传染性病毒的能力。BPLF1可以通过去泛素化稳定EBV病毒的聚合酶Pol使得EBV病毒在感染人体DNA后容错率变高，使病毒的DNA在损伤部位可以继续复制，从而增加了病毒的感染性[33]。研究发现BPLF1能够与TNF受体相关因子6(TRAF6)相互作用并使其去泛素化，抑制溶菌性感染期间的NF-κB信号传导[34]，增强病毒的传染性，喉癌与舌癌的形成均与EBV病毒紧密相关，BPLF1的存在可能促进喉癌与舌癌发展。

在舌癌组织中，泛素特异性肽酶9X(ubiquitin-specific protease 9X,USP9X)上调可以导致程序性死亡受体-配体1(PD-L1)去泛素化并稳定表达，PD-L1抑制T细胞的活化和增殖使得癌细胞逃脱了T细胞免疫监视，阻止USP9X定位PD-L1可能是治疗舌癌的有效策略，尤其是转移性肿瘤[35]。

去泛素化酶头帕肿瘤综合征蛋白(CYLD)属于USPs去泛素蛋白酶家族，在舌癌中它的缺失可以激活NF-κB和MAPK信号通路。NF-κB转录因子可促进细胞存活并诱导体内对病原体，如：病毒或细菌病原体，炎性细胞因子的先天性和适应性免疫，使其在癌症发生和发展过程中被异常激活。CYLD的主要靶标是由NF-κB必须调节蛋白(NEMO)和细胞因子反应性IκB激酶(IKK)复合体亚基IKK-γ共同介导的经典NF-κB信号传导，CYLD使NEMO去泛素化，阻止了IKK复合物磷酸化IκB和NF-κB活化[36]，从而降低了肿瘤的异常激活(舌癌)，CYLD的缺失也可以通过促进ALK5以稳定NF-κB来增加舌癌的侵袭性。

2.5去泛素化酶对于舌癌与喉癌的治疗作用 随着泛素化酶成为临床中治疗肿瘤的靶点，人们越来越关注去泛素化酶靶向药物在癌症治疗中的应用，由于大多数去泛素化酶是半胱氨酸酶，使其更易成为候选药物。去泛素化酶抑制剂的作用在于：①增加多泛素化蛋白分子的聚集；②减少单泛素化的部分；③改变一些分子活性，尤其是去泛素化酶介导的致癌蛋白持续存在[37]。抑制去泛素化酶会导致蛋白酶体功能受损和功能折叠错误的蛋白质聚集，从而导致肿瘤细胞毒性和死亡[38]。一些去泛素化酶与癌症有关，可用作新型抑制剂的靶标[39，40]，目前，通过筛选去泛素化酶抑制剂库，经过测试发现化合物2X-0324被确认对喉癌具有潜在的放射增敏功效(RER>1～1.86)。Vif1和Vif2是去泛素化酶USP7的蛋白酶抑制剂，可以调节p53介导的抗癌作用，有潜力成为治疗喉癌的分子靶向药物[41]。氮杂环庚烷-4-酮(azepan-4-ones)和b-AP15是USP14与UCHL5的一种蛋白酶抑制剂，它们可以诱导高分子量的聚泛素蛋白的积累，从而导致未折叠蛋白反应(UPR)增强，二者均可以抑制口腔舌癌的发展[42]。在舌癌中b-AP15可以剂量依赖性显著抑制肿瘤细胞的生长并增加细胞凋亡；在体外条件下，它们可以克服硼替佐米的耐药性(Chen,2002)。

3 小结

去泛素化酶可以逆转目标蛋白的泛素化，使底物蛋白在泛素化和去泛素化之间保持平衡，维持细胞稳态。去泛素化酶具有四种不同的作用机理：加工泛素蛋白前体，在泛素化过程中回收泛素分子，切割泛素蛋白链和逆转泛素蛋白与底物的缀合[38]。去泛素化酶在体内调节许多细胞功能，包括蛋白酶体依赖性的蛋白质降解[38]、基因表达[43]、细胞周期进程[44]、染色体分离[45]、DNA修复[46]以及细胞凋亡[47]等。USP22、USP7表达升高与喉癌不良的临床预后有关，可以成为判断肿瘤预后的生物标志物；BAP1的表达可以升高喉癌与舌癌的放疗耐受性，是提高头颈部鳞癌放疗敏感性的潜在靶点；USP9X、USP14等去泛素化酶在口腔舌癌中表达量升高，且有促进癌细胞增殖的作用；USP4的沉默可以抑制癌细胞的凋亡，增加了舌癌细胞持续存活率；作为免疫抑制性疾病，UXP9X、CYLD1及BPLF1通过免疫细胞的逃逸抑制机制或促进病毒感染传播的作用加速喉癌与舌癌肿瘤的发展；去泛素化酶因其结构优势逐渐被认为是癌症的治疗靶标，去泛素化酶的抑制剂2X-0324、b-AP15等可能成为喉癌或舌癌新的治疗策略。

目前，已有多种文献报道去泛素化酶在喉癌与舌癌的发生发展中扮演重要角色，包括：在肿瘤细胞组织中的异常表达、与放疗和免疫机制紧密的相关性。虽然去泛素化酶调控下游效应机制及功能尚不清晰，但作为治疗喉癌与舌癌的潜在靶点，更好地研究这种调节机制在产生作用时的位点与靶向治疗肿瘤时的副作用尤为重要。随着去泛素化酶在喉癌与舌癌中的作用机制及功能研究的逐步加深，可以使去泛素化酶作为分子靶点治疗癌症成为可能。