慢性乙型肝炎病毒感染和原发性肝细胞肝癌

张 珊 纪 冬 陈国凤

中国现年龄标准化肝癌发生率为18.3/10万，病死率为17.1/10万，其中男性发生率为27.6/10万，病死率为25.6/10万，女性发生率为9.0/10万，病死率为8.6/10万[1]。原发性肝癌发生率与病死率均高，其中肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)占比超过80%，是原发性肝癌中最常见的类型。HCC发生相关的危险因素很多，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)相关的肝硬化是其主要诱因。HBV慢性感染与HCC的发生有着非常密切的联系。

一、乙型肝炎病毒

慢性HBV感染一直是我国高发生率的传染病之一，最新数据表明，现在我国一般人群乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)流行率为5%～6%，慢性HBV感染患者约7000万[2]。即使HBV疫苗已被广泛应用于临床，其发生率也一直居高不下。HBV侵袭人体的过程与病毒的多方面特性有关。

首先在肝细胞内，HBV中存在的共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)是HBV持续感染无法彻底消除的根本原因，只有消灭所有受感染肝细胞的cccDNA，使HBV无法继续复制，才能获得疾病完全治愈[3]。cccDNA虽然无法自行复制，但它依靠自身稳定性以及体内多种途径对cccDNA库的补充始终维持体内含量的相对平衡，即使接受长期抗病毒治疗，也只能使cccDNA含量降低，而不能完全清除[3,4]。作为反映体内病毒情况的重要指标，对cccDNA含量的长期监测很有必要，但cccDNA的检测方法尚有多方面不足，技术仍需改进。在治疗方面，临床上也逐渐开始应用通过多途径的以cccDNA为靶点的新型疗法，如病毒蛋白负性调控cccDNA、表观遗传学修饰、在分子层面上进行基因组编辑等。乙型肝炎的完全治愈未来可期[3,5]。

近年来研究发现，乙型肝炎核心相关抗原(hepatitis B core related antigen，HBcrAg)与cccDNA密切相关，或许可作为替代cccDNA的指标反映体内病毒情况。在体内多个生物指标如HBV DNA及HBsAg等检测不到或无法检测时，HBcrAg仍处于较为稳定且可被监测的水平，因此对疾病监测、治疗效果评估等起到了良好的作用[6]。另外HBcrAg也被证明是肝癌的独立危险因素，HBcrAg>10kU/ml的中等HBV DNA载量(2000～19999IU/ml)患者与高HBV DNA载量患者的肝癌危险比比较，差异无统计学意义[7]。

HBV目前已经发现的基因型共10种(A～J)，陆续还有超过30余种基因亚型正在不断被发现。不同的基因型在地理上和突变体频率上都存在着差异，跟疾病的发生、治疗和预后等关系密切。我国B型与C型病毒是慢性肝炎、肝硬化及肝癌的主要诱导因素[8]。

HBV与宿主基因组的整合是HBV致癌的主要原因之一。从肝炎到肝癌，HBV整合数量呈增加态势且与病毒载量呈正相关，HBV整合靶向基因在许多癌症相关通路中数量庞大[9]。HBV DNA与宿主细胞DNA的整合往往发生在肿瘤克隆扩增早期，通过引起肝细胞内遗传物质的改变，降低染色体的稳定性，从而引发一系列细胞信号通路及基因组表达转录的异常反应，增加癌症的发生率[9,10]。通过高通量HBV整合检测及RNA测序，基因组内共发现4225个整合位点，多为脆弱的基因组位点以及功能性区域，如端粒酶反转录酶基因(TERT)、KMT2B和CCNE1等，这些位点均被证明在癌症发生过程中发挥重要作用[11]。

除此之外，乙肝病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)在肝癌的发生、转移等多个环节中均起重要作用。首先HBx蛋白可调节cccDNA的转录。HBV感染后，染色体结构维持(structural maintenance of chromosomes，Smc)复合物Smc 5/6与cccDNA结合并靶向其降解，但是由于HBx对Smc 5/6复合物的抑制作用，cccDNA的稳定性得以维持[12]。HBx还可通过激活叉头框A1(forkhead box A1，FoxA1)因子信号上调雄性特异性致死因子2(male-specific lethal 2，MSL2)，上调的MSL2在肝细胞中泛素化降解载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽(apolioprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide，APOBEC)家族成员APOBEC3B，由此达到增加cccDNA稳定性的目的，促使肝癌发生[13]。其次HBV DNA与宿主基因组的整合也对病毒癌蛋白HBx的表达有着重要影响。基因组的整合调节癌蛋白HBx的持续表达后不仅使细胞转录和增殖控制失调，还增加肝细胞对致癌因子的敏感度[14]。另外还有许多研究发现，多条HBx影响肝癌发生的调节通路，如HBx激活去乙酰化酶2(sirtuin 2，SIRT2)启动子上调SIRT2，从而增加HBV复制及HBV介导的HCC转化[15]。HBx通过核转录因子NF-κB(nuclear transcription factor-κB)通路促进肝癌细胞生长及转移等，髓样特异性蛋白S100A9在其中起到了关键性作用[16,17]。

二、宿主因素

慢性HBV患者的感染有多种影响因素，如年龄、性别、肝纤维化及肝硬化程度、糖尿病等。糖尿病最近被证明是肝癌发生的独立危险因素之一，糖尿病的存在或较高的血糖水平与罹患肝癌和重大慢性肝病的风险较高有关[18]。

近年来研究发现，微小RNA(microRNA，miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)、白介素21(interleukin-21，IL-21)单核苷酸多态性等均为影响HBV感染患者肝癌发生率的重要因素。

蛋白质编码RNA在分子生物学中一直占据十分重要的地位，然而近年来研究发现，除编码RNA外，非编码RNA在癌症发展过程中的作用不容忽视[19]。非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)可由长度分为200～100000nt的长链非编码RNA以及多种<200nt的短链非编码RNA(small non-coding RNA，sncRNA)。

miRNA是sncRNA中非常重要的一类，miRNA作用的机制是结合在翻译模板mRNA的3′末端使mRNA沉默，无法参与蛋白质翻译。对HBV阳性和阴性肝癌患者分别进行miRNA表达谱的测定，共筛选出8个miRNA参与了与HBV无关的HCC，5个miRNA参与了HBV感染，还有7个miRNA在HBV相关HCC中发生了特异性改变。经预测，这些与HBV相关的HCC miRNA可能参与了转录，RNA聚合酶Ⅱ启动子，MAPK信号通路的蛋白质磷酸化，黏着斑和肌动蛋白细胞骨架等方面的调节并作用于AGO2、TP53、CCND1和其他11个对HCC发生和HBV感染有重大影响的基因[20]。

lncRNA在肝癌发生过程中的作用也不容小觑。1例高通量测序研究分析了20例HCC患者的肿瘤血栓和邻近的正常肝组织中的lncRNA表达，发现了107个与转移相关的lncRNA失调[21]。另外在一项肝癌干细胞(liver cancer stem cells，LCSC)相关研究中发现，通过使用转录组微阵列比较CD13+CD133+HCC细胞(定义为LCSC群体)和CD13-CD133-HCC细胞中的lncRNA表达，共鉴定出286个差异表达的lncRNA。除此之外还发现，lncTCF7、lncBRM41和lnc-β-catm42在维持LCSC自我更新中起到了非常重要的作用[22]。lncRNA中的HOTTIP是典型的癌症相关lncRNA，通过深度测序获得了HBV-HCC lncRNA图谱，发现HOTTIP被显著上调，HOTTIP可显著抑制HBsAg、乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)和HBV复制的产生[23]。

IL-21单核苷酸多态性与HBV感染及肝细胞肝癌密切相关。利用PCR-LDR方法检测发现，IL-21基因的单核苷酸多态位点的不一致性影响着HBV感染及HBV相关的肝细胞肝癌的发生。分别对慢性HBV感染患者、肝细胞肝癌患者及健康对照组进行测序，发现编号为rs2221903的IL-21基因多态序列中，AG基因型相比AA与GG基因型，在慢性HBV感染患者中比例较高，AG基因型是患慢性HBV感染的风险因素。与此相反，rs12508721中TT基因型与CT和CC基因型比较，在慢性HBV感染患者和HBV相关的肝细胞肝癌患者中比例较低，TT基因型是患慢性HBV感染及HBV相关的肝细胞肝癌的保护因素[24]。

由于遗传多样性，HBV感染宿主方面的影响因素还有很多值得继续发掘。

三、抗病毒治疗

现有的有效肝癌治疗方法包括根治疗法(手术切除、消融治疗、肝移植)、肝动脉栓塞+化疗(TACE)、放射治疗、靶向治疗及生物治疗等，无论采用何种方案，抗病毒都是治疗乙肝相关肝癌患者的基础。抗病毒治疗不仅可以降低HCC发生率，还可以减少肝癌复发率。现有的抗病毒疗法均以抑制病毒复制为基本原理，缺少彻底清除cccDNA的根治性疗法，大多数HBV感染患者需要终身进行抗病毒治疗。

替诺福韦与恩替卡韦作为国际公认的抗病毒治疗一线药物在临床上的应用相当广泛，已有多项实验证明，两种药物在HBV治疗上具有显著疗效，但其在肝癌发生率方面是否存在差异目前仍未完全明确。韩国一项全国性历史队列研究对此进行了探索，队列一的研究对象为2012年1月1日～2014年12月31日开始使用恩替卡韦(n=11464)或富马酸替诺福韦二吡呋酯片(n=12692)的慢性乙型肝炎初治患者，数据来自韩国国民健康保险服务数据库。队列二作为验证，纳入了2010年1月1日～2016年12月31日接受恩替卡韦(n=1560)或替诺福韦(n=1141)治疗的CHB患者的医院队列。结果显示，在人群队列中，替诺福韦组的HCC年发生率(0.64/100人年)显著低于恩替卡韦组(1.06/100人年)。通过多变量校正，结果显示，与恩替卡韦组比较，替诺福韦组的HCC风险和全因病死率或移植率未显著下降。而对人群和医院队列分别进行倾向性匹配后，替诺福韦组显示出显著降低的HCC风险。这表明与恩替卡韦治疗比较，替诺福韦治疗使HCC发生风险在以人群为基础的成人慢性乙型肝炎患者中显著降低，该发现在医院队列中也得到了验证。鉴于HCC患者的预后较差，这些发现可能在预防CHB感染患者癌症发生方面具有重要的临床意义[25]。这两种药物之间的具体差别及临床应用方法目前仍在讨论中，还需要有更多的证据来证明。

抗病毒治疗对预防肝癌发生方面的作用毋庸置疑，但HBV感染患者经过长期的抗病毒治疗后即便符合临床治愈标准，也并非意味着病毒在体内完全清除。与未感染HBV者比较，低水平病毒血症(low-level viremia，LLV)患者在肝癌发生方面的风险仍有升高。一项回顾性队列研究纳入了875例初治HBV单感染患者，给予恩替卡韦单药治疗，患者出现两类结局，分别是持续病毒学应答(sustained virological response，SVR)与LLV。该项研究对患者的HCC发生风险进行比较发现，无论患者是否患有肝硬化，LLV均与较高的HCC风险相关[26]。

有研究对当HBV DNA水平处于不同基线或肿瘤处在不同阶段时，抗病毒治疗对早期切除术后的HBV相关肝癌患者的无病生存期(disease-free survival，DFS)和总体生存期(overall survival，OS)的影响进行了讨论。结果显示，高基线HBV DNA水平是所有患者短DFS和OS相关的危险因素。HBVDNA≥2000IU/ml的患者中，抗病毒治疗与延长的DFS和OS显著相关。对于HBV DNA<2000IU/ml或无法检测的患者，抗病毒治疗在延长DFS和OS方面并未显示出明显的益处，LLV患者与抗病毒治疗之间的关系并未明确[27]。而2020年一项回顾性队列研究对此做出了回答，研究表明，抗病毒治疗可显著改善LLV患者的OS，但对患者的DFS并无明显影响[28]。两项研究的结论说明，高水平HBV DNA与早期肝癌患者预后较差有关。抗病毒治疗对所有患者预后均有良好影响，应作为HBV相关HCC患者的常规术后治疗。除此之外，另一项大规模队列研究结果显示，无论基线病毒水平或肿瘤分期，预防性抗病毒治疗均可以显著改善行介入治疗的HBV相关HCC患者的长期生存，其疗效与介入治疗类型无关[29]。

虽然肝癌的发生与预后与多方面条件都有着不可或缺的关系，但最重要的因素仍是抗病毒治疗的进行与否。所以对HBV患者来说，对肝癌的早发现、早诊断以及早治疗是获得良好预后的最为重要的条件。

四、展 望

慢性HBV感染与肝细胞肝癌的高患病率与发生率始终威胁着人们的生命健康。本文从乙肝病毒、宿主以及抗病毒治疗3个方向阐述了相关因素对这两种疾病的影响。乙肝病毒因素方面，cccDNA是乙肝病毒无法彻底消灭的根本原因，因此研究者正以此为靶点研究有效的抗病毒治疗方案，以求彻底消灭HBV。除cccDNA外，影响乙肝病毒的因素还包括核心抗原的存在、癌蛋白的表达、HBV基因型以及HBV DNA与宿主基因组的整合等。宿主方面microRNA、lncRNA、IL-21单核苷酸多态性等在近年来一直备受关注。抗病毒治疗方面，一方面以cccDNA为靶点的研究正在进行，另一方面市场上现有的药物的具体有效性与安全性还未彻底明晰。本文仅对这3个方面影响因素做了分析阐述，未来研究的最新进展应该持续关注。