化学发光免疫分析法的研究进展

张晨磊

天津市宝坻区人民医院检验科 (天津 301800)

化学发光免疫分析法是一种结合化学发光和免疫分析的检测方法，不仅操作简单、检测速度快，而且具备较高的检测灵敏度与特异度。近年来，化学发光免疫分析法被广泛应用于临床疾病诊断、环境检测与食品检测等领域，均取得了较好的应用效果。1977年，化学发光免疫分析法被首次提出，至今已发展了40余年，检测体系趋于成熟[1]。但在实际临床应用过程中，检测数量众多、成分复杂或低丰度的样品时，常规化学发光免疫分析法往往无法达到预期的效果，故需对化学发光免疫分析法进行优化，以提升其检测效果。本文旨在综述新型化学发光免疫分析法及其与其他技术联合应用的现状，并展望化学发光免疫分析法的研究前景。

1 新型化学发光免疫分析法(纳米粒子)

以往的常规化学发光免疫分析法虽可满足一般检测需求，但在实际应用过程中，仍有可能出现特异度不足以及信噪比不高等情况[2]。近年来，基于纳米粒子发展而来的新型化学发光免疫分析法取得了较好的进展，使检测效果得以有效提升，各类纳米粒子的引入可缩短检测时间、降低背景干扰值、提升检测的灵敏度及特异度等，常用的纳米粒子包括磁性纳米粒子、金纳米粒子等。

1.1 磁性纳米粒子

磁性纳米粒子是指可均匀分散于一定基液中的胶态复合材料，具有超顺磁性、较高的比表面积、可修饰功能基团等特性。常用的磁性物质有纯铁粉、羰基铁、磁铁矿、正铁酸盐等,其粒径一般在10～100 nm。在开展免疫分析的过程中，分离抗原-抗体免疫复合物通常需耗费较长的时间，且操作步骤烦琐。将磁性微粒引入化学发光免疫分析法中，使其成为免疫反应和分离的固相载体，是加速抗原-抗体免疫复合物分离的有效措施。磁性微粒与抗体相连后，通过免疫反应即可捕获靶物质，由此形成免疫复合物，受外加磁场作用后，免疫复合物便会发生滞留，进而达到分离的效果，同时，还可降低样品中基质对检测产生的干扰。目前，基于磁性微粒的化学发光免疫分析法在癌胚抗原、甲胎蛋白、皮质醇等物质的检测中已得到了广泛的应用[3]。有研究报道，在对人血清前列腺特异抗原进行检测时，相较于化学发光免疫分析法，应用基于磁性微粒的化学发光免疫分析法，不但能减少约50%的反应试剂用量，还可缩短反应时间，降低背景值，提高灵敏度[4]。

在基于磁性微粒的化学发光免疫分析法中，磁性微粒的表面修饰有利于提高检测效率，其不仅可直接修饰抗体，还可应用于链霉亲和素放大体系、异硫氰酸荧光素的异硫氰酸荧光素-抗异硫氰酸荧光素体系。有研究报道，在对磁性微粒进行修饰时，首先应用聚醚酰亚胺，其次应用戊二醛，将其与抗体进行连接，可加大磁性微粒和抗体间的距离，从而减少免疫反应时存在的空间位阻[5]。

1.2 金纳米粒子

在实施化学发光免疫分析法检测时，金纳米粒子可对鲁米诺发光体系内自由基的产生与电子转移起到催化作用，增强化学发光反应，进而提高检测灵敏度。有学者分析了金纳米粒子在化学发光反应中的作用，发现金纳米粒子的引入可使鲁米诺发光体系内发光反应的信号强度提升4倍以上，表明金纳米粒子可催化鲁米诺发光反应[6]。有研究指出，应用酶标记抗体修饰金纳米粒子后，将其用作反应抗体来检测癌胚抗原，其灵敏度较常规化学发光免疫分析法提升了3个数量级[7]。由此可知，金纳米粒子的应用不仅可促进自由基的产生及电子转移，而且可作为信号放大载体，增强发光信号[8]。

2 与其他技术的联合

除了纳米粒子外，与其他技术的联合也可提高化学发光分析法的检测性能。

2.1 与化学发光共振能量转移技术的联合

化学发光共振能量转移是指受到供体基团的激发作用后，将一对偶极子介导的能量由供体转移至受体，转移时无光子介入，不会出现辐射反应。化学发光共振能量转移的信号背景值明显低于荧光共振能量转移，可提高检测的灵敏度，但能量转移效率较低[9]。为解决这一问题，很多学者为选择合适的能量受体开展了相关的研究。其中，以金纳米粒子为首选，有学者在检测甲胎蛋白时，将辣根过氧化酶催化的鲁米诺发光体系作为能量供体，金纳米粒子作为能量受体，甲胎蛋白不同的抗原表位的抗体分别与辣根过氧化酶及金纳米粒子进行结合，开展双抗夹心反应，通过结合2种抗原表位的抗体，达到共振能量转移的目的，结果发现，化学发光共振能量转移的效率与纳米粒子的直径密切相关，相较于直径为20 nm的金纳米粒子，直径为40 nm的金纳米粒子具备更高的转移效率，考虑主要是由于后者具备更大的消光系数，且具有更大的表面积，可修饰更多的抗体[10]。为提高能量转移效率，部分碳纳米材料也被应用到化学发光共振能量转移中，如石墨烯、氧化石墨烯等，同时被证实为化学发光的超级受体。

2.2 与微阵列芯片技术的联合

化学发光免疫分析法是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异度的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。微阵列芯片是指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物(如玻片、尼龙膜等载体)的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子反应，通过特定的仪器，如激光共聚焦扫描仪或电荷偶联摄影像机快速、并行、高效地检测分析反应信号的强度，从而判断样品中靶分子的数量。有学者在硅烷化的玻璃微阵列芯片上实施化学发光免疫分析，各检测孔内放置待检测物的对应抗体，并引入金纳米粒子，达到催化的效果，用于同时检测甲胎蛋白、癌胚抗原、糖类抗原125(carbohydrate antigen 125，CA125)与糖类抗原153(Carbohydrate antigen 153，CA153)蛋白，结果显示，在48 min内，48个样品检测工作全部完成，同时金纳米粒子的介入提升了信号强度，达到了高灵敏度及高通量检测的目的[11]。也有研究者在硅烷化的玻璃芯片上应用化学发光免疫分析法检测癌胚抗原及糖类抗原199(Carbohydrate antigen 199，CA199)蛋白，亦取得了不错的效果[12]。由此可见，微阵列芯片技术是实现化学发光免疫分析高通量检测的重要技术。

2.3 与免疫层析技术的联合

免疫层析法的原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当干燥的硝酸纤维素一端浸入样品(尿液或血清)后，基于毛细现象，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异度结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异的免疫诊断。有学者联合应用化学发光免疫分析法与免疫层析技术定量检测沙丁胺醇与莱克多巴胺，首先，在层析膜的结合区固定酶标莱克多巴胺抗体与沙丁胺醇抗体，然后，在2个检测区对沙丁胺醇-牛血清白蛋白与莱克多巴胺-牛血清白蛋白进行固定，再将样品滴加至硝酸纤维素膜一端后，随着样品的流动进入到固定有抗体的结合区，使样品内存在的抗原与抗体结合，过量未发生结合的酶标抗体则会继续流动，进入到检测区位置，分别结合沙丁胺醇-牛血清白蛋白与莱克多巴胺-牛血清白蛋白，上述整个检测过程不超过20 min，操作简单，检测速度相对较快[13]。

2.4 与流动注射技术的联合

基于流动注射技术的化学发光免疫分析法已在临床广泛应用，多通道喷墨式微量给样可提升聚二甲基硅氧烷聚合作用，在多孔玻璃上开微孔反应器，孔洞直径为1.5 mm，来实施免疫反应与发光检测，该技术不仅可减少样品用量，而且具备极高的检测灵敏度。以免疫球蛋白A作为检测样本时，其可取得0.1 ng/ml的检测下限，明显低于微孔板的0.86 ng/ml[14]。根据微孔反应器具备的微阵列模式，通过增加给样通道可实现多组分的微量检测。

3 结论与展望

随着研究的不断深入，各种新型化学发光免疫分析法以及化学发光免疫分析法与其他技术的联合应用可有效提升化学发光免疫分析法的灵敏度及特异度，并实现多组分同时检测。但在实际应用过程中，化学发光免疫分析法仍存在不足，如仪器体积较大，检测结果可能受到样品基质的影响，检测小分子的精密度受限等[15]。为进一步提高化学发光免疫分析法的检测效果，临床仍需开展更多的试验研究，如降低化学发光免疫分析检测仪器的成本，缩小仪器体积，使其更便于携带；强化处理检测样本基质的能力，提高检测稳定性；进一步完善多通道以及多组分的化学发光免疫分析检测技术，提升检测效率；发展化学发光免疫分析法联用技术，扩大其应用范围。