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海南粗榧研究进展

2021-12-04林玲黄川腾陈飞飞董晓娜

热带林业 2021年1期
关键词:内生生根真菌

林玲,黄川腾,陈飞飞,董晓娜

海南省林业科学研究院(海南省红树林研究院),海南海口571100

海南粗榧(Cephalotaxus manniiHook.f.),为三尖杉科,三尖杉属乔木植物,已被列入中国植物红皮书中,并确立为国家I级重点保护植物[1]。目前从海南粗榧中已分离并鉴定出生物碱50种[2],其主要成分三尖杉酯碱类对治疗白血病和急性淋巴病有特殊疗效,是目前抗癌最有潜力的自然药源之一,但是由于树种自身原因和人为破坏与干扰,该树种濒临灭绝[3]。庞晓慧等[4]综述了海南粗榧的资源学研究及相关的繁殖技术研究。随着研究的深入,不少的新研究内容和技术相继报道,该文拟较全面对国内外诸多学者围绕海南粗榧核形态学、药用成分、内生真菌、遗传多样性、群落学、繁育技术等现阶段的研究进展进行了综述,并提出未来的研究方向,以期为其深入研究和保护利用提供参考。

1 资源学研究

海南粗榧在国内主要分布于海南、广东、广西、云南和西藏,在海南又主要分布于尖峰岭、霸王岭、鹦哥岭、吊罗山等自然保护地中[5]。海南的海南粗榧株数和蓄积量均约占全国总量的90%,占粗榧资源绝对优势[1],该树种是海南传统的优良用材树种,在商品材采伐时代被列为二类材[6]。

2 种群和群落学研究

海南粗榧多生于海拔700m~1200m的山地雨林中的山地黄壤,在海南常与红锥(Castanopsis hystrix),母生(Homalium ceylanicum),鸡毛松(Dacrycarpus imbricatusvar.patulus)等混生[3]。对海南霸王岭的海南粗榧群落植被生物多样性研究结果表明,不同样方中的乔、灌、草各层的生物多样性指数出现极显著差异,但同一样方中乔木层和灌木草本层生物相差不大,主要优势种为红紫麻(Oreocnide rubescens)、野芭蕉(Musa balbisiana)、药用狗牙花(Tabernaemontana bovina)等[7]。

3 结构解剖学研究

对海南粗榧的叶片结构和茎次韧皮部解剖结果表明,为双环型气孔,气孔密度47.3个/mm2~88.1个/mm2,无皮下层,有些叶肉中具星状石细胞、短石细胞、纤维状石细胞,有些完全无,下表面具明显的角质突起[8-9],但杜道林等[10]研究表明,海南粗榧叶表面气孔为12列~15列(多数为14列),气孔结构为完全或不完全的双环型气孔或单环型气孔,大小变化较大,副卫细胞2个~6个(多数为2个),同时表明环境因子对海南粗榧叶气孔结构影响差异很大,与土壤质地、厚度、营养状况、坡度、光照等环境因子关联度很大[11]。

4 分子生物学

釆用RAPD技术从分子水平分析,结果表明海南粗榧除了与篦子三尖杉的亲缘关系较远,支持将篦子三尖杉独立成组[12];乔飞等[13]研究海南粗榧PDS基因和利用NJ法建立系统进化树,表明海南粗榧PDS是真核的裸子植物,其位置处于单独一个分支上。

5 遗传多样性研究

向志强等[14-15]对吊罗山、卡法岭、尖峰岭、霸王岭、黎母山5个海南粗榧种群开展研究,对海南粗榧种群遗传多样性和遗传分化程度分析结果表明,种群遗传多样性水平较低,种群间遗传分化程度较低,黎母山种群与其它种群分化最大,可能是受到传粉时盛行的风向影响有关。调查结果表明,5个种群的植株总体形态都未产生分化,而单一性状上,仅吊罗山种群体现出群体化的趋势,但分化不明显;王峻玉等[16]开展以上5个海南粗榧种群染色体水平遗传多样性研究,结果表明海南粗榧不同种群核型表现出一定差异,但是差异不显著,种群内的变异量总是远远超过种群间的变异量,5个海南粗榧种群间在常规染色体的遗传变异中,来自于种群间的变异平均只有10%,约90%变异来自于种群内的个体和细胞间,种群间进行着频繁的基因交换。

6 海南粗榧药用研究

6.1 有效药用成分分离提取

20世纪70年代初至80年代以来,从海南粗榧中分离出17个生物碱和2个内酯[17],至目前,已从海南粗榧中分离鉴定出50余种生物碱,其主要成分为三尖杉酯类生物碱[2]。三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱、异三尖杉酯碱、脱氧三尖杉酯碱、海南粗榧新碱、海南粗榧内酯、红壳松生物碱(简称红碱)有较强的抗肿瘤活性,已开发成治疗多种癌症的药物[18-21];还从海南粗榧乙醇提取物中分离得到3个苯丙素类化合物和2个木脂素类化合物,均具有抗氧化活性[22-23]。

6.2 有效药用成分合成

6.2.1 悬浮细胞和生物碱的合成研究

海南粗榧现有资源严重稀缺,海南粗榧悬浮细胞来促进三尖杉醋类碱的合成,可以有效解决稀有药用资源的供需矛盾。陈林等[24]使用海南粗榧愈伤组织进行悬浮培养,利用HPLC技术检测悬浮细胞和培养基中生物碱的含量;陈蕾等[25]利用RACE技术从海南粗榧中克隆出紫杉烷13α-羟化酶基因,合成紫杉醇。龙晓娟等[26]研究表明在海南粗榧悬浮培养第15d分别添加100μmol/L茉莉酸甲酯和50μmol/L水杨酸最有利于三尖杉酯类碱的合成。蒋旋娴等[27]研究指出L-色氨酸及其衍生物5-MT能抑制代谢支路,促进代谢流向产物三尖杉酯类碱的方向;潘亚华等[28]研究表明海南粗榧细胞固定化培养,抑制了细胞的生长,延长了细胞的生长周期,但缩短了细胞生产三尖杉酯碱的周期。

6.2.2 海南粗榧新碱研究

海南粗榧新碱的研究比较热门。20世纪80年代初,从海南粗榧的树皮和三尖杉中分离到海南粗榧新碱,通过单晶衍射以及波谱学,最终确定海南粗榧新碱的结构[29-30],学者通过动物实验发现海南粗榧新碱具有边缘抗肿瘤活性,对白血病有一定疗效,但尹大力等[31]却发现海南粗榧新碱的溶解性较差,动物体内吸收很少。为改善溶解性能及提高活性,发现并筛选了一些具有较好生物活性的衍生物,并通过人工手段,合成较好的抗肿瘤的药物[32-35]。

6.2.3 内生真菌研究

植物内生真菌是指生活在植物体内或生活史的一定阶段处于植物体内的真菌,与宿主形成长期互惠共生关系[36],许多内生真菌可产生与宿主相同或相似的次生代谢物,具有多种活性,包括抗肿瘤活性[37]。陈苹等[38]从海南粗榧中分离得到72株内生真菌,其中68株为半知菌类,其对宿主具有一定的组织专一性;蔡坤等[39]从海南粗榧树皮样品中分离得到213株内生真菌,它们分属34个属,未知属37株;齐静等[40]分离获得416个内生真菌菌株,分属12个属,其中10属为半知菌,2属为子囊菌;吴延春等[41]从海南粗榧中第一次分离获得生赤壳属内生真菌。可见随着研究不断深入,分离鉴定出来的内生真菌越来越多。

7 繁育技术研究

7.1 种子育苗技术

王有生等[42]和王献溥[43]研究报道海南粗榧为雌雄异株,10月~11月种子成熟,树种结实具有明显的大小年、结实量少,且休眠期较长。而种子在低温储藏80d~100d催芽后,可提高发芽率。曾祥全等[44]研究指出,未经催芽就播种,240d以后才陆续发芽,发芽不整齐,而且发芽率较低。在常温下湿沙催芽90d左右,播种60d后,种子发芽率约30%;采用湿沙在低温下层积催芽90d左右,播种60d后,其种子发芽率可提高到72%。莫世琴等[45]5℃~10℃低温下用湿沙或湿椰糠层积催芽90d,45d后,种子就开始发芽,出芽率可达80%。

7.2 扦插育苗技术

王献溥等[43]在秋季,以河沙为基质,3年生枝条作插穗,未经任何处理开展扦插试验,生根率为26.5%;使用激素ABT1000mg/L处理插穗,生根率可达82.5%。而使用激素IBA1000mg/L~1500mg/L处理插穗的效果也较好,插条生根率可达70.0%以上,平均生根数为3.8条~4.0条;椰糠基质扦插效果均好于河沙、沙混土和表土的基质,侧枝扦插较直生枝容易生根[46-47]。研究还发现秋季或冬季的扦插效果好与其他季节[48-49]。刘进平等[50]以2000mg/L的萘乙酸(NAA)处理未完全木质化的枝条3h的生根效果最好,成活率在90%以上,完全不处理则不能生根成活;黄桂华等[48]研究则以甘蔗渣和表土按1:1混合搅拌为基质,以1500mg/L的激素IBA浓度为生根剂处理插穗,生根率最高,可达到84.89%;陈飞飞等[49]选取0.5年生~1年生健壮枝条,剪成长度8cm~10cm的插穗,以2000mg/L的ABT溶液蘸药3min处理,河沙、椰糠、红土等比例配制成的混合基质,扦插生根效果较好,生根率最高可达80.67%。

7.3 组织育苗技术

选用海南粗榧的茎尖、芽、茎段、幼苗根段的离体组织进行组培,能诱导出愈伤组织,但未能进行离体繁殖[43,51]。而李志英等[52]采用海南粗榧的茎段进行组织培养,小苗最高成活率达80%左右。外植体灭菌和愈伤组织褐变是影响组织培养成果的两大因素,针对这两大难题,刘进平等[53]选用海南粗榧温室扦插苗的嫩茎段外植体灭菌和愈伤组织诱导开展实验,筛选出MS+0.5mg/LNAA+0.5~1.0mg/LBA+2.5~4.0mg/L2,4~D培养基,以70%酒精表面消毒处理1min后,以0.1%氯化汞溶液消毒12min,诱导愈伤组织效果最好;王成韬等[54]探讨不同灭菌方法对海南粗榧外植体污染和细胞活性的影响,结果表明,以75%酒精灭菌1min、臭氧灭菌30min,再用0.1%HgCl2溶液灭菌10min的灭菌方法最佳,其外植体污染率5%,愈伤组织诱导率95%,外植体细胞活力比对照提高38%。王成韬等[55]研究发现叶片外植体诱导产生的愈伤组织褐变率较茎段外植体低,抗褐变剂和激素的合理配比能有效地抑制愈伤组织培养中的褐变,促进其生长。

8 研究展望

海南粗榧属于中国珍稀濒危植物资源,为国家I级重点保护野生植物,由于其自然生境遭受破坏和盗伐的威胁,导致种群数量和规模急剧下降、资源不断减少等问题。为了更全面地保护海南粗榧树种,建议应从以下3个方面加强研究。

(1)深入开展内生真菌研究。由于海南粗榧资源有限,单纯的利用海南粗榧来提取有效药物,难于规模化生产,但是继抗癌药用植物细胞组织培养之后,利用抗癌药用植物内生真菌来生产抗癌药物成为一个新的热点,从海南粗榧内生真菌已发现不少的代谢产物并筛选出具有抗肿瘤活性的菌株及活性成分,可见对于有效药用成分的筛选和开发,海南粗榧内生真菌具有很大的研究空间。

(2)深入开展培育技术研究。为了能尽快缓解市场对海南粗榧的需求,对海南粗榧种子、扦插及组织培养、细胞培养等繁育技术进行了大量的研究,但至今海南粗榧未能生产大量苗木,还不能为推广奠定坚实的基础,而高效的种植技术也是扩大资源量的有效方法,如何克服因为留有位置效应侧枝扦插未能产生直立植物(匍匐植株),如何更有效率用侧枝扦插产生的匍匐植株,则需要更深入开展培育技术的研究。

(3)做好保育研究工作。海南粗榧为珍稀濒危保护植物,但至今自然生境下海南粗榧的的光、温、水、肥、热等生态学、生物学特性还有许多方面还未清楚,海南粗榧的许多的致濒原因还未认识到位。因此,需要继续做好海南粗榧的保育研究。

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