产气荚膜梭菌C58-1株β毒素的克隆与表达

姚春阳，曹雨欣，徐文豪，马先强

（1. 山东省滨州畜牧兽医研究院 256600；2. 滨州医学院药学院 264000；

3. 滨州市滨城区农业农村综合服务中心 256600；4. 惠民县农业农村服务中心 251700）

产气荚膜梭菌又称魏氏梭菌，是一种人兽共患的病原体，魏氏梭菌按照分泌毒素类型主要分为A、B、C、D、E五种类型[1，2]，A型菌引起人畜气性坏疽，还可以引起马匹的坏死性肠炎，B型产气荚膜梭菌可引起羊羔痢疾、肠毒血症，特别是一周内的羊羔极易感染，临床表现为腹泻、食欲不振等，且一经出现，致死快，救治困难，C型产气荚膜梭菌是奶牛、犊牛及羊肠毒血症、仔猪红痢和鸡的坏死性肠炎的主要病原菌，D型可引起羔羊、绵羊、山羊、牛及灰鼠肠毒血症。E型偶尔引起犊牛和羔羊肠毒血症[3-6]。魏氏梭菌为条件性致病菌，当天气、饲养条件骤变时往往导致牛、羊、鸡、家兔等动物发病，造成养殖户的重大损失[7，8]。

B型产气荚膜梭菌可产生α、β、ε3种致死性毒素，β毒素是该菌主要致病因子之一，具有细胞毒性，β毒素可特异性地结合在内皮细胞上，引起血管坏死、出血和继发的缺氧组织坏死，β毒素也能损害神经系统，从而使动物表现严重的精神沉郁[9]。β毒素基因可编码 336个氨基酸分子量大小约为35 ku，本研究将β毒素基因进行了克隆、测序及截短表达，研究如下。

1 材料与方法

1.1 主要材料及试剂

B魏氏梭菌 C58- 1、pET32a（+） 和Ecoli. BL21感受态细胞均为本实验室保存和制备。

LB培养基为青岛海博生物技术有限公司产品；pMD 18-T、限制性核酸内切酶快切酶 BamHⅠ和SalⅠ、Premix Taq、T4DNA连接酶为TaKaRa 试剂公司所售，细菌基因组提取试剂盒和胶回收试剂盒为Omega公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细菌基因组提取 根据Omega公司产品相关产品说明书进行细菌基因组提取。

1.2.2 引物设计

参考GenBank: KP064405.1魏氏梭菌β毒素基因，设计合成一对引物，如表1:

表1 引物序列及长度

1.2.3 β毒素基因克隆

使用PCR技术扩增β756片段，反应参数: 94℃ 3min，94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 1min，共32个循环，72℃延伸10min。PCR产物回收，连接PMD 18-T载体后送生工上海测序公司测序。

1.2.4 PETβ-756重组载体的构建和初步鉴定

双酶切所用酶为Qcut BamH Ⅰ和Q cutSal Ⅰ，表达质粒和回收的β756基因同时用这两个酶进行鉴定，重组载体命名为PETβ-756。

1.2.5 β毒素基因的表达

将PETβ-756转化至BL21感受态，涂板于氨苄霉素抗性平板上，过夜培养，挑取阳性单菌落，按照1∶100的比例转接入氨苄霉素抗性LB液体培养基中，同时设置空白对照组，37℃摇床180转摇菌到OD600=0.6，加入IPTG 至终浓度 1mmol /L，37℃，180转诱导培养5h后。

1.2.6 β756基因的蛋白质电泳检测

取4.5mL诱导后的重组表达菌，离心收集沉淀后用0.35mL的PH为7.4的无菌PBS重悬菌液，超声破碎重组菌，离心后取沉淀并用0.35mL 8M的尿素进行溶解，将诱导前样本及诱导后样本及沉淀用相关试剂进行处理后，85℃水浴5min，使用12%的蛋白质电泳胶进行蛋白质电泳分析，跑完蛋白胶后，用市售的即用型考马斯亮蓝快速染色液进行染色，染色后用脱色液对染色胶进行脱色，次日用蒸馏水冲洗两次，用蛋白胶照相仪对其观察结果。

2 结果

2.1 β毒素DNA的PCR扩增及回收

β毒素DNA经0.8%的琼脂糖凝胶电泳后，在组外光下可见约678bp的基因条带（图1），与计划中结果相符。

图1 PEDV PCR扩增β基因

2.2 表达载体的构建

重组载体PETβ-756经过1.2.4中所用酶切鉴定后，在紫外光下756bp大小处可见相关β毒素基因片段，测序结果经软件分析后未发现任何一个DNA碱基发生突变，这表明重组载体PETβ-756成功构建。

2.3 β毒素基因的表达

经12%SDS-PAGE电泳后，在约45KD大小处有可见目的条带，其大小与预期蛋白质分子质量相符，经BandScan5.0软件分析表达的β毒素融合蛋白量约占胞内总体蛋白量含量的20%（图2）主要以不可溶形式存在。

图2 β基因的SDSPAGE分析

3 讨论

魏氏梭菌产生的毒素众多，其中致死性毒素至少有12种，B型魏氏梭菌起主要致病作用的毒素有3种（α、β1、ε），β毒素蛋白序列与目前公布的所有产气荚膜梭菌B型和C型同源性均在99.4%以上，β毒素作为产气荚膜梭菌B型和C型重要毒素蛋白，具有良好的抗原性。本试验克隆了B型魏氏梭菌C58-1β毒素的主要抗原区域，并成功对克隆基因进行了载体构建及测序分析，而且本试验所构建的含有β毒素截短基因的重组质粒在大肠杆菌中的表达效率较高，表达量约菌体蛋白的20%。该蛋白的成功表达为今后魏氏梭菌亚单位疫苗的研发提供了一定的理论依据。