回流法与湿法超微粉碎法提取中药延胡索的有效成分分析

苏娟娟，尤文质，白晨龙，邱恒宜，刘永宽

(厦门市中医院，福建 厦门 361009)

延胡索为临床常用的中药材，其主要有效成分为延胡索乙素。现代药理研究发现，延胡索乙素具有较好的镇痛、催眠、镇静效果，治疗效果已获得临床认可[1]。延胡索乙素主要通过现代工艺提取制备，常用提取方法包括回流法与湿法超微粉碎法，回流法是用乙醇等易挥发的有机溶剂对药材成分进行提取[2]。湿法超微粉碎法则是将药物与溶剂同时加入粉碎机，粉碎时溶剂可进入药物组织内部，机械振动研磨组织，使溶剂快速吸收有效成分，达到提取作用。两种方法提取制备延胡索乙素时哪种方法提取效率更高仍存在较大争议[3-4]。本次研究使用回流法与湿法超微粉碎法提取延胡索的有效成分，采用高效液相色谱法(HPLC)测定两种方法提取的有效成分。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

中药材延胡索自安徽亳州市中药饮片厂购入，经鉴定符合2020版《中国药典》[5]中关于延胡索的相关规定；使用美国安捷伦液相色谱仪(型号：An gilent1100)以及二极管阵列检测器；奥豪斯仪器上海有限公司生产的精密电子天平(型号：AR124CN)；上海跃进医疗器械厂电热恒温水浴锅(型号：hh-6)；天津泰斯特仪器有限公司生产的超微粉碎机(型号：FW135)；上海安亭科学仪器厂生产的离心机(型号：Anke T gL-16C)；粒度分析仪(型号：MICRO RACS3500)；日本日立公司扫描电镜(型号：hitac hi S-3000N)；延胡索乙素(中国药品生物制品检定所，批号：150422)，水为超纯水，甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 提取方法 ①回流法：准确称取延胡索5 g，加入70%乙醇50 ml，进行4 h回流提取，在30 s、1 min、2 min、3.5 min、5 min、10 min、15 min、20 min、30 min取适量药液，进行滤过备用。②湿法超微粉碎法：准确称取延胡索100 g，加入1 000 ml乙醇，乙醇浓度为70%，进行超微粉碎。在30 s、1 min、2 min、3.5 min、5 min、10 min、15 min、20 min、30 min取适量药液，离心后取上清液备用。

1.2.2 色谱条件 色谱柱：Lic hrosp here C18，4.6 mm×250 mm，5 μm，280 mm检测波长，以1.0 ml/min流速为宜，设置30 ℃柱温，延胡索乙素计算理论塔板数>3 000。

1.2.3 粒度与电镜 以对照组作为参考，用水将离心药渣重新分散，对分散后的药材粒径分布进行测定，可使用激光光散射法测定；药渣干燥后，喷金镀膜，之后使用电镜扫描观察。

2 结果

2.1 HPLC指纹图谱

两种提取方法提取延胡索乙素时具有一致的出峰时间与峰形，提示所提取的物质相同。见图1。

图1 回流法与湿法超微粉碎法HPLC指纹图谱分析

2.2 延胡索提取率

延胡索乙素提取时，湿法超微粉碎法5 min的提取率与回流法1 h相当，2 h提取率与4 h相当。见图2。

a：湿法超微粉碎法；b：回流法图2 回流法与湿法超微粉碎法提取延胡索乙素的溶出量比较

2.3 湿法超微粉碎粒径

由湿法超微粉碎法5～30 min的延胡索粒径分布数据可知，随着粉碎时间延长，粒径会不断变小，但提取率不会随着时间延长而不断增加，粒径在粉碎20 min时延胡索乙素的提取率最高。见图3。

图3 粉碎时间与粒径分布关系

2.4 电镜分析

采用湿法超微粉碎法处理后，随着粉碎时间延长，延胡索细胞破碎越彻底，5 min时细胞处于较为完整状态，10 min细胞不完全破壁，20 min细胞基本破壁，30 min细胞破碎彻底。见图4。

3 讨论

延胡索为临床常用的中药材，属于方中君药，主治经闭通经、胸胁、跌扑肿痛、产后淤阻等，具有理气止痛、活血散淤之效，尤以止痛见长[6]。延胡索通过现代工艺提取药材中的有效成分为延胡索乙素，其效果确切，已被临床广泛应用，关于延胡索乙素的提取方法也备受关注[7]。既往延胡索乙素多通过渗漉法进行提取，提取率较高，不易产生杂质，为常用的提取方法之一。但该方法所需时间较长，提取时间往往超过24 h，其操作繁琐复杂，限制其推广应用，需要寻找更加便捷的提取方法[8]。

回流法是近些年常用的延胡索乙素提取方法，具有较高的提取率。但该方法属于化学法，易产生新物质，导致纯度不足，且存在操作繁琐，需要消耗较多能量。与渗漉法相比，回流法一定程度上缩短提取时间，但仍需4 h左右的回流提取，无法满足当今社会的快节奏要求，加之该方法回流使用的冷凝水，浪费水资源[9]。湿法超微粉碎法利用超声波空化、机械、热学机制使溶剂分值的运动速度及穿透力增加，能够高效提取延胡索中的有效成分，一般5 min左右即可完成提取，应用优势突出。另外，湿法超微粉碎法提取过程中无须加热，完全避光，尤其适用于热敏性成分的提取，提取效率高，大大缩短提取时间，节能环保。本研究结果显示，两种提取方法提取延胡索乙素时具有一致的出峰时间与峰形，提示所提取的物质相同。延胡索乙素提取时，湿法超微粉碎法5 min的提取率与回流法1 h相当，2 h提取率与4 h相当；随着粉碎时间延长，粒径会不断变小，但提取率不会随着时间延长而不断升高，粒径在粉碎20 min时提取率最高；随着粉碎时间延长，延胡索细胞破碎越彻底，5 min时细胞处于较为完整状态，10 min细胞不完全破壁，20 min细胞基本破壁，30 min细胞破碎彻底。表明回流法、湿法超微粉碎法均能完成延胡索中延胡索乙素的提取，但后者能够同步完成超微粉碎与提取，所需时间更短，提取效率更高。湿法超微粉碎法提取延胡索乙素呈现随时间增加提取率快速升高至高峰后持平随后稍有下降的趋势，粉碎5 min内提取率骤升，与溶剂开始吸附能力强、含量少有关，随着吸附时间延长，逐渐达到饱和，而5 min时有效成分基本溶出完全，随着时间延长，提取率反而出现下降趋势[10]。随粉碎时间的延长粒径变小，电镜图显示粉碎5 min，延胡索粒径在150 μm左右，随着粉碎时间延长粒径不断变小细胞破碎也就越完全，30 min基本成细小碎片。粒径太大会导致提取不完全，而太小则会降低提取率，故粉碎20 min时延胡索乙素溶出率最大，提取率最高，符合粒径分布结构特征。

综上所述，回流法、湿法超微粉碎法均能完成延胡索中的有效成分延胡索乙素的提取，但湿法超微粉碎法能够同步进行超微粉碎与提取，可缩短提取时间，且提取效率更高，值得推广。