紫草素在缺血再灌注损伤中的应用研究

胡伟，曹磊，董岩，付生军，杨立

(兰州大学第二医院泌尿外科，兰州 730030)

缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，IRI)是临床常见的病理性损害，多发生于休克、严重创伤以及器官移植等手术过程中[1]。而再灌注后的炎症可进一步加重IRI[2]，甚至造成不可逆性损害。炎症损伤是影响缺血组织再灌注治疗获益的主要原因，也是影响移植器官早期功能恢复及患者长期存活的独立危险因素[3]。IRI是一种无菌性炎症，以往可通过清除自由基、减轻钙超载及抗炎等减轻这种炎症损伤[4]。近年来，中药因不良反应小、治疗窗宽、价格低廉等特点在抗炎治疗方面优势显著。紫草及其制剂在中医临床治疗中广泛应用，而紫草素是一种从紫草根中提取的萘醌类活性单体成分[5]，目前尚未应用于临床治疗。随着国家对中医药研究的积极推动，关于紫草素药用价值的理论研究已成为研究热点，目前主要集中于皮肤、肝脏、肿瘤防治等领域。紫草素在肿瘤细胞凋亡、坏死、自噬等过程中发挥重要作用，另外，紫草素在减轻组织器官IRI的研究报道也日益增多，但目前研究主要处于细胞和动物实验阶段[6-8]。现就紫草素在IRI中的应用研究予以综述。

1 紫草素

紫草素主要以新疆紫草、内蒙紫草和滇紫草为来源[5]。临床上常用紫草素治疗急、慢性肝炎；局部应用紫草素可治疗皮肤烧伤、促进伤口愈合；紫草素油型制剂还可用于治疗皮炎、湿疹等；眼科常用紫草素治疗单纯疱疹病毒性角膜炎；紫草及其衍生物亦常被作为药物、化妆品及食品的着色剂[9-10]。

紫草素不易溶于水，可溶于无水乙醇等有机溶剂，与非离子表面活性剂调配后可制成水溶液，在碱性溶液中溶解度较高，遇酸则沉淀析出[10-11]。同位素放射示踪实验发现，紫草素进入小鼠体内后迅速发生代谢转化，经灌胃或肌内注射1 min后即可在血浆中测得放射性，5～7 min达高峰，但首关效应明显，因此经口服或腹腔注射的生物利用度较低，仅为34.3%[12]。食物对紫草素的吸收有促进作用[13]，紫草素入血后与血浆蛋白结合率高，联合用药时可能与其他药物产生竞争作用，影响药效的发挥；另外，紫草素在小鼠不同组织或器官之间的分布随给药时间的不同而存在较大差异，提示可能存在二次吸收再分布现象[14]，临床用药或动物实验时应考虑这一点。有学者指出，摄入较高剂量[15 mg/(kg·d)]的紫草素会对小鼠产生一定的毒性作用[15]。紫草素经肝脏分解后主要随胆汁进入粪便排泄，以肾-尿液排泄为辅，仅有小部分以原形药从尿液及粪便中排出[12-13]。

紫草素具有抗炎、镇痛、抗肿瘤、抗病原微生物、免疫调节、保肝、止血、心血管保护等药理作用，其抗癌作用的主要机制包括参与细胞凋亡、坏死、自噬相关的信号转导以及癌细胞的侵袭、转移和抗肿瘤血管生成等[16]。目前认为，紫草素的抗炎机制与白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、核因子κB、CC趋化因子及其受体、环加氧酶2等密切相关[5]。炎症损伤是许多IRI疾病的重要病理机制之一，抑制过度炎症是治疗IRI的重要靶点[17]。紫草素在抗炎、免疫调节、血管保护等方面的优势作用可以为其预防或治疗IRI提供参考。

2 IRI的发病机制

IRI是指组织器官在缺血后重新获得血液供应时,组织或器官的功能未恢复，反而出现代谢功能障碍及结构破坏加重，甚至发生不可逆性损伤的病理现象[4,18]。心、脑、肾或机体其他组织器官均可发生IRI，其主要的发病机制概括为以下几点。

2.1自由基大量生成 再灌注为组织提供血液和氧气的同时，还产生大量自由基。自由基指外层电子轨道上存在不配对的单个电子的原子或分子等物质，其中由氧诱发的自由基称为氧自由基，包括超氧阴离子、羟自由基等，过氧化氢等活性氧类虽不属于自由基，但其在IRI中发挥重要作用，因此常一并讨论[19]。由于活性氧类和自由基具有不稳定且活泼的化学性质，因此具有较强的破坏DNA双链结构、蛋白质变性失活、脂质过氧化等能力[20]。生物体内有两大抗氧化应激防御系统，即酶性抗氧化剂和非酶性抗氧化剂。正常情况下，体内活性氧类等自由基水平与超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、泛素、维生素A等自由基清除物质水平处于动态平衡[21]。当缺血缺氧时，组织器官内次黄嘌呤等物质大量堆积，再灌注时瞬间涌入的过量氧气分子提供的电子受体将次黄嘌呤经黄嘌呤氧化酶转化为尿酸[22]，在此反应过程中，超氧阴离子、羟自由基、过氧化氢等氧化应激产物大量产生。当机体处于缺氧等应激条件下时，体内儿茶酚胺水平不断升高，而儿茶酚胺可在单胺氧化酶的作用下，生成超氧阴离子，导致体内自由基水平进一步升高[23]。值得注意的是，在白细胞尤其是中性粒细胞聚集、招募和浸润过程中同样伴随氧自由基的大量生成[24]。此外，由于自由基破坏、钙超载等因素对线粒体膜的影响，导致线粒体内电子传递效能降低，正常的自由基清除系统无法及时有效发挥作用，同时线粒体内的氧自由基大量堆积[25]，最终导致体内抗氧化物质消耗殆尽、自由基与清除系统的平衡被打破，造成组织损伤。

2.2细胞内钙超载 正常情况下，胞内游离钙离子(Ca2+)浓度仅约为胞外的1/10 000，其中作为第二信使的游离钙仅占胞内Ca2+的0.005%[26]。组织器官缺血缺氧导致机体代谢产物堆积、pH值升高、细胞内酸中毒、离子交换异常，使Na+-Ca2+交换增加[27]。此外，胞内钙超载引起组织器官IRI的作用机制还包括：①氧自由基等对生物膜的破坏致使胞外Ca2+内流增加[24]；②线粒体氧化磷酸化功能受到抑制，ATP依赖的离子泵功能障碍，导致胞内多余的Ca2+无法及时转运出去，进一步加重IRI对细胞的损害[28]。研究表明，细胞内Ca2+积聚过多可通过各种途径引起线粒体通透性转运孔道开放，促进凋亡相关基因激活，导致组织细胞死亡[29-30]。而且，缺氧等应激可激活下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴，导致儿茶酚胺大量产生，通过α、β肾上腺素受体分别促进细胞内钙库释放Ca2+和胞外Ca2+内流，导致细胞产生不可逆性损伤[31]。

2.3白细胞聚集活化及炎症反应过度激活 动物实验和临床观察均证明，白细胞尤其是中性粒细胞在IRI区域大量聚集，与白细胞呼吸暴发及炎症级联反应相互促进、相互影响[6,32-33]，其具体机制目前尚未完全阐明，可能与中性粒细胞、内皮细胞中的黏附分子、趋化因子表达增强有关[24,34]。中性粒细胞聚集、活化过程中伴随着大量炎症细胞因子释放，如IL-1β、IL-6和TNF-α等[35]，而这些细胞因子会激活更多的炎症效应细胞，导致炎症级联反应，加重IRI[36]。

3 紫草素对IRI的保护作用

3.1减轻组织水肿、坏死 各种组织或器官缺血再灌注均可造成相应细胞变性、坏死，破坏细胞膜屏障功能，造成细胞内空泡形成、细胞间隙增宽、细胞崩解死亡，表现为组织水肿、坏死的广泛形成，因此减轻上述病理损害被视为干预或治疗IRI的有效依据[27]。在肝脏节段性IRI模型中，缺血再灌注组大鼠肝组织广泛坏死、水肿，经不同剂量紫草素预处理后，再灌注后3个时间观察点的肝组织水肿均显著改善，且坏死区域明显减少，尤以再灌注后6 h的改善效果最为显著，同时血清天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶水平均显著降低[6]。缺血性脑血管病给患者的生活和家庭造成了严重影响，早期干预可以减轻脑水肿，减小脑梗死面积。在一项针对小鼠脑IRI模型的研究中，再灌注导致神经元细胞核萎缩、胞质嗜酸粒细胞增多和细胞水肿等IRI特征性病理损害，而紫草素干预治疗可减轻缺血再灌注导致的上述组织病理损害，同时可降低神经元的萎缩程度和速度[37]，可能为缺血性脑血管病患者的治疗提供帮助。另外，在心肌缺血再灌注中，经紫草素预处理后，小鼠心肌梗死面积、血清心肌肌钙蛋白Ⅰ、肌酸激酶同工酶MB等心肌损伤标志物水平也均显著改善，且这种作用呈剂量依赖性[8]。

3.2抑制炎症细胞聚集和激活 再灌注后的炎症瀑布反应是导致IRI的病理基础之一，而炎症细胞的聚集和激活在其中起关键作用。研究表明，再灌注可激活TNF-α、IL-1β等炎症细胞因子受体，而TNF-α、IL-1β等与对应受体结合后可激活众多炎症相关细胞因子信号通路，进而引发炎症级联反应[38-39]。白细胞浸润，特别是中性粒细胞聚集是炎症反应的典型特征之一，而髓过氧化物酶的活性与中性粒细胞的浸润程度及数量呈正相关[40]。在急性肺损伤[41-42]、急性肝损伤[43]等所致的组织炎症反应中均可观察到大量中性粒细胞聚集以及TNF-α、IL-1β、髓过氧化物酶水平升高。以上实验表明，紫草素提前干预或再灌注后及时治疗均可抑制髓过氧化物酶活性，减少中性粒细胞聚集和炎症细胞因子激活。

3.3减少炎症细胞因子释放和氧化应激水平 再灌注可造成炎症因子相关基因和信号通路激活，刺激炎症细胞聚集和激活，引发炎症反应，反映在分子水平上就是氧化应激产物或炎症细胞因子的大量释放。相关研究表明，在肝脏缺血再灌注后6 h，IL-1β、IL-6和TNF-α等炎症细胞因子水平达峰值，而紫草素预处理可显著降低炎症细胞因子水平，且降低程度随紫草素剂量增加而增大[6]。

氧化代谢对组织细胞的生存至关重要，这与活性氧的产生密切相关[37]，活性氧类等自由基清除不利可进一步造成脂质过氧化、蛋白质变性失活等损害，加重IRI。在急性肝损伤模型中，对乙酰氨基酚实验组小鼠体内谷胱甘肽被大量消耗、超氧化物歧化酶活性降低，同时脂质过氧化产物丙二醛大量产生，而紫草素干预组小鼠体内的谷胱甘肽和超氧化物歧化酶水平降低则并不显著，丙二醛的产生量也较少，肝组织出血、细胞变性坏死等均显著改善[43-44]，表明紫草素在改善对乙酰氨基酚所致肝脏氧化应激损伤方面具有强大作用。

紫草素改善氧化应激和炎症反应主要涉及的信号通路包括磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号通路[6,8,43,45]、核因子κB信号通路[42,45]、促分裂原活化的蛋白激酶信号通路[42]以及IL-1β/c-Jun氨基端激酶/磷酸化c-Jun氨基端激酶信号通路[39]等，但目前哪条信号通路在其中占主导地位尚不明确，这些通路相互交叉、相互影响，共同决定体内炎症反应的发展方向。上述研究为紫草素作为治疗IRI的新型药物提供了参考，也为探究紫草素在改善和保护器官IRI方面的机制研究提供了新的思路和方向。

3.4减少细胞凋亡和自噬 过强的氧化应激或炎症反应最终导致组织或器官的不可逆性损伤，造成细胞凋亡或死亡，引起器官功能障碍。细胞死亡与器官IRI密切相关，凋亡作为一种程序性细胞死亡方式，在缺血再灌注中尤其常见，主要受B细胞淋巴瘤-2、胱天蛋白酶等基因家族调控；自噬的主要特点是形成自噬小体或自溶酶体，目前认为自噬主要受Beclin-1、微管相关蛋白1轻链3和p62等基因调控，通过透射电子显微镜可以观察到特征性的自噬小体[6,39]。在肝IRI动物模型中，与缺血再灌注组相比，紫草素治疗组中的抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-2水平在各指定检测点均上调，而促凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白、胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3水平均下调；经紫草素预处理后，Beclin-1、微管相关蛋白1轻链3和p62蛋白的表达均受到抑制，通过透射电子显微镜观察发现，紫草素预处理组的溶酶体和自噬小体数量均显著减少；另外，肝组织免疫化学染色与聚合酶链反应及蛋白质印迹的结果一致，为上述结果提供了更进一步的有力证据支持[6]。黄泽林[46]研究表明，紫草素预处理可抑制大鼠肢体IRI中的细胞凋亡，上调B细胞淋巴瘤-2水平，下调B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白水平。紫草素拮抗促凋亡蛋白表达、促进抗凋亡蛋白表达的作用在低氧-复氧诱导的心肌细胞损伤模型[47]以及心肌IRI动物模型[8]中均得到了证实。

4 小 结

近年预防或治疗IRI已成为研究热点。紫草素作为一种天然的脂溶性萘醌类药物，在肿瘤的抗炎和免疫调节等方面显示出巨大作用，甚至可能作为一种新型的免疫抑制剂用于临床移植[48]。IRI主要由自由基生成增多、细胞内钙超载和炎症反应过度激活引起。了解紫草素在急性组织损伤、缺血性疾病以及心、脑和肝IRI等方面的研究现状，探究紫草素减轻IRI、保护组织器官功能的作用机制，可为进一步深入研究紫草素在器官IRI方面的详细作用机制提供帮助，也为其作为IRI的潜在预防和治疗药物提供新思路，未来紫草素可能用于减轻器官移植围手术期缺血再灌注造成的脏器损害，但具体方案有待进一步深入研究。