富血小板血浆的临床应用

马婉茹 聂志扬 胡俊华

富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）的采集是指将血浆中血小板浓缩到高于全血中血小板水平的方法。PRP是血小板浓度达到患者自身血小板浓度的3～6倍时，利用全血成分沉降系数的不同从而离心得到的血小板血浆，其中含有多种促进组织修复和再生的细胞因子等生物活性物质，目前已经成为再生医学治疗中的重要部分[1]。PRP中血小板被激活后可以释放多种生长因子，白介素和其他细胞因子。丰富的细胞因子具有抗炎、趋化、抗凋亡和促进细胞增殖的作用，改变受损部位的微环境，减轻疼痛并加快组织的愈合和再生[2-3]。同时PRP的易于获取、无免疫排斥反应、无创性等优点均促进了PRP临床应用的增加[4]。

1 PRP的生理特征 血小板来源于骨髓巨核细胞的细胞质并以圆盘状无核小颗粒的形式存在，它的主要功能是参与生理性止血，促进血块收缩和维持血管内皮的完整性[5]。血小板细胞质内含有储存颗粒-α颗粒和致密体等，受到刺激后将储存在α颗粒、致密体或溶酶体内的物质排出的现象，称为血小板释放或血小板分泌。血小板储存颗粒包括合成代谢因子（血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor [PDGF]-AA，-BB，and -AB），转化生长因子β因子（transforming growth factor-β，TGF-β），血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF），碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor 1，IGF-1），分解代谢因子（白细胞介素-1b（interleukin-1b，IL-1b））和基质金属蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13，MMP13）和分解代谢阻断剂（IL-1受体拮抗剂）[6]。血小板可维持血管壁的完整性，其释放的VEGF和PDGF等可促进血管内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞的增殖，也有利于受损血管的修复。此外，被释放的物质除了来自于血小板颗粒外，也可以来源于临时合成并即时释放的物质，如血栓烷A2（TXA2），能引起血小板聚集的因素，多数也能引起血小板释放反应。最近的研究将血小板功能扩展到通过释放趋化因子、细胞因子和一些免疫调节配体（例如CD154）来调节局部炎症事件，血小板可以通过CD154在体内外诱导树突状细胞成熟、B细胞等型转换和增强CD8+T细胞反应。有血小板输注研究表明，在病毒感染过程中，单用血小板源性的CD154可以增强T淋巴细胞的功能，从而增强对病毒再激发的保护作用[7-8]。上述血小板功能的研究提示PRP可能对免疫细胞也发挥一定作用。PRP中除了含有血小板以外，也含有白细胞成分。白细胞是炎症反应、宿主抵抗感染原和伤口愈合的重要介质。其中，中性粒细胞参与伤口愈合，单核细胞和巨噬细胞通过清除受损细胞来促进组织修复[9]。因此白细胞的存在可能会导致促炎性细胞信号传导和局部组织分解代谢，从而与PRP治疗的预期愈合效果相反。肌腱模型的体外研究表明，降低PRP中的白细胞浓度可以降低炎症反应，这可能比最大限度地提高血小板浓度以优化PRP疗效更为重要[10-13]。PRP采集的离心过程会减少或消除红细胞的存在。红细胞的主要功能是携带氧气，对于组织修复至关重要，但是红细胞释放的一氧化氮介导了软骨组织对类胰岛素生长因子-1（insulin-like growth factors -1，IGF-1）的不敏感性[14]。在应激条件下，红细胞内的血红蛋白分子所含的铁催化自由基有助于病原体的破环，但是自由基也可以在促炎性信号反应中诱导宿主细胞凋亡。因此PRP中红细胞的含量需要进一步探讨[9，15]。

2 PRP的制备和分类 PRP手工制备一般采用自体静脉血两步离心的方法。采集患者静脉血5 mL，并在存在抗凝剂的情况下，以460 g转速离心8～10 min，通过第一次的离心，血液从顶部到底部分为三层：（1）贫血小板血浆（platelet-poor plasma，PPP）（2）血沉棕黄层（buffy coat，BC）（3）红细胞层（red blood cells，RBCs）。将PPP和浅表的BC转移到新的试管中以3 000 g转速离心10 min，丢弃PPP后获得终产品PRP，包含整个BC，其中大部分的血小板、白细胞和残留的极少RBCs悬浮在富含纤维蛋白的血浆中[16]。除手工制备PRP以外，血细胞分离机也被用于制备自体PRP。相较于手工制备PRP，机采制备PRP的优点包括：（1）白细胞以及红细胞清除率达99%以上。（2）临床医生可以根据患者自身血小板浓度灵活设定PRP浓度，保证PRP的治疗疗效。（3）一次采集可以供多次使用，满足患者短时间多疗程的需求。PRP的制备有多种方法，无论何种方式制备PRP，都需要对其进行质量检测，包括血小板计数、生长因子浓度、有无细菌污染及有无沉淀等。研究者应根据自己的实际情况选择适当的方法，并使用获得国家Ⅲ类医疗器械注册证的卫生材料和在封闭状态下分离制备。中国输血协会输血管理学专业委员会在2021年推出了PRP制备技术规范化和制品质量控制的专家共识，专家们对PRP制备人员条件、材料要求、设备等均做出了要求，并推荐成分血单采机采集制备为首选方法[17]。

近年来，不同研究者根据PRP成分的不同对PRP进行分类。Dohan Ehrenfest分类依据白细胞和纤维蛋白存在与否将PRP分为4类：（1）纯PRP或者贫白细胞PRP：活化后纤维蛋白网络密度低并且无白细胞水平或者低白细胞水平。（2）富白细胞的PRP：活化后纤维蛋白网络密度低并且白细胞水平相对较高。这两类PRP都可以以液态或者活化的凝胶形式存在。（3）富血小板纤维蛋白或者贫白细胞的富血小板纤维蛋白：活化后纤维蛋白网络密度高并且无白细胞水平或者低白细胞水平。（4）富白细胞血小板纤维蛋白：活化后纤维蛋白网络密度高并且白细胞水平也相对较高。这两类PRP只能以凝胶的形式存在[16]。

DeLong等人描述了血小板、活化和白细胞（platelet，activation，white blood cells，PAW）的系统。PAW分类是以血小板数量、血小板激活方式和白细胞存在与否为依据。（1）血小板浓度分为P1（≤基础值），P2（基础值～7.5×105个/μL），P3（7.5×105个/μL～1.25×106个/μL）和P4（＞1.25×106个/μL）。（2）总白细胞含量，分为高于或低于/等于基线水平，如果BC层包含中性粒细胞则是高于基线水平，如果BC层不包含中性粒细胞则是低于基线水平。（3）活化条件[18]。这个分类相较于Dohan Ehrenfest分类而言，研究者对于血小板的数量做了绝对定量并且考虑了中性粒细胞在PRP中的作用。2015年，MAUTNER等研究者强调了红细胞对于PRP活性的作用，将PRP的分类系统命名为PLRA（platelet、leucocyte、RBCs、activation），根据血小板的绝对数量，白细胞的浓度，中性粒细胞的百分比，红细胞含量和外源性激活物的存在对PRP进行划分[19]。之后，DEPA分类更是纳入了PRP产物的有效性，这与PRP中血小板比例相对应，也更加强调PRP纯度的重要性[20]。随着机采血小板的广泛应用，MARSPILL分类也包含了采集PRP的方式和离心转速次数[21]。因此，研究者将PRP分类因素总结如下：（1）方法：手工或者机采；（2）活化：PRP是否被激活；（3）RBCs：较高或者较低，较低水平是比基础水平减少15倍；（4）转速：PRP采集是一步离心或者两步离心；（5）血小板浓度：分类为高于基础值的2～3倍，4～6倍，6～8倍，8～10倍；（6）影像指导：有或者无指导；（7）白细胞：富白细胞PRP或贫白细胞PRP；（8）光激活等[22]。尽管已有很多的PRP分类规则，但是仍没有一个统一的标准，这可能也取决于PRP制作和成分的异质性。

3 PRP临床应用

3.1 促进创面愈合与再生：PRP含有丰富的生长因子，促血管生成因子和细胞黏附分子，这些因子可以促进细胞的增殖，分化和血管生成，对愈合过程起到了积极作用。血小板及分泌的多种细胞因子参与了创面愈合的4个过程：止血、炎症、增殖和重塑。临床上使用PRP治愈的创面主要是糖尿病足溃疡。糖尿病足溃疡是血管病变、神经病变和感染综合导致的结果，再加上压力点的损伤最终发展成足部骨骼畸形。糖尿病足容易出现溃疡，在糖尿病人群中发病率为4%～10%，并且复发率高，截肢率也高，导致患者生活质量显著下降[23]。近年来，再生医学为慢性伤口的治疗提供了新的解决方案，例如PRP既可以促进免疫调节，也可以促进难以愈合的伤口组织修复。在2006年，DRIVER等在对使用PRP治疗糖尿病下肢伤口的队列进行12周的随访中发现，治疗组19个患者中有13个患者伤口愈合（68.4%），而对照组21个患者有9个患者伤口愈合（42.9%），而且PRP治疗组的平均愈合时间较对照组缩短（45天vs.85天）。除单独使用PRP之外，研究者也将PRP与自体间充质干细胞结合以治疗糖尿病足，效果良好，这也为PRP与细胞治疗的联合应用提供了新的依据[24-25]。

PRP不仅对糖尿病溃疡有积极的疗效，也可以促进周围神经的再生。周围神经是由髓鞘和非髓鞘的感觉，运动和自主神经轴突束组成的离散的球根器官。在发生周围神经损伤后，将发生多细胞多分子反应。神经元细胞核移位，细胞质发生嗜酸性改变，合成信使RNA和大量蛋白等物质为修复做准备。周围施旺细胞大量增殖，巨噬细胞吞噬轴突碎片和崩解的髓鞘，大量施旺细胞分泌神经营养因子促进轴突的生长，将其与目标器官重新连接[26]。由此可见在周围神经损伤修复的过程中，神经元需要多种生长因子的协助从而促进细胞的增殖和迁移。PRP可作为辅助周围神经损伤修复的一种治疗方法。越来越多的体内外实验证据表明，PRP及其所含有的纤维蛋白支架不仅具有神经保护的作用，而且还可以作为感觉和运动功能神经肌肉单位恢复的增强剂[27-29]。ZHENG等研究者发现浓度为2.5%～20%的PRP可以刺激施旺细胞的增殖和迁移，诱导神经营养因子包括神经生长因子（nerve growth factor，NGF）和胶质源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）的产生[3]。PRP也可以通过IGF-1和VEGF相关机制促进脊髓组织中的轴突生长，并且PRP中的TGF-β1抑制了神经元轴突的生长[30]。PRP可以改善损伤部位的周围微环境，克服炎症反应并且刺激血管生成[31]。在膝关节炎的治疗中，关节内和骨内联合注射PRP具有免疫调节和抗炎作用，这可能与HGF，IGF-1，PDGF和TGF-β等生物活性因子有关[32-33]。PRP诱导的血管生成在扩大新生血管灌注能力和减轻严重骨骼肌缺血后内源性组织纤维化方面具有有效的功能[34]。KIM等研究者在大鼠坐骨神经缺损的模型中发现填充PRP的自体内向外的静脉移植对大鼠坐骨神经功能的改善优于对照组[35]。以上结果都提示我们PRP对于周围神经损伤修复起到了积极的作用。

雄激素性脱发（androgenetic alopecia，AGA）又称脂溢性脱发，其主要病理表现是进行性毛囊微小化，遗传因素和雄激素作用是主要致病因素[36]。近年来由于社会竞争压力增大，不良的生活作息都导致AGA患者逐渐增多。而脱发区注射PRP也已被用作AGA的治疗。有研究结果显示血小板释放的生长因子可能会作用于卵泡膨出区域的干细胞，刺激卵泡的发育，促进新生血管的形成[37]。PRP诱导的抗凋亡调节因子和信号通路的激活，如Bcl-2蛋白和ERK/AKT信号通路等都延长了细胞的存活[38]。除此之外，PRP作用下的成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor 7，FGF-7）/β-catenin信号通路也诱导了干细胞的分化，延长了头发的生长周期，从而促进了头发的生长[39]。PRP成分中的VEGF和PDGF也可以刺激脱毛区血管的生成[40]。Rinaldi等研究者发现PRP治疗的患者组头发比曲安奈德药物治疗组头发生长显著增加。研究者在研究开始、2个月、6个月和12个月这4个时间节点对所有患者采用SALT评分，即由3名对治疗方式不知情的独立评估者进行评估，患者对灼烧/瘙痒的感觉进行主观评估，研究者使用皮肤镜观察及检测细胞增殖标志物Ki-67的水平，综合上述指标评估患者头发再生程度。曲安奈德药物治疗的患者中有27%的患者在12个月时完全缓解，而PRP治疗的患者中有60%的患者完全缓解，PRP能增加头发再生，减少头皮灼痒的感觉，细胞增殖标志物Ki-67的水平显著升高，这些指标都明显高于曲安奈德药物治疗和安慰剂治疗的患者。在6个月时，曲安奈德药物治疗组中38%的患者已有脱发斑块的出现，而PRP组中的患者在此时间点均未发现有脱发斑块。在12个月时，曲安奈德药物治疗组中71%的患者出现疾病复发，而PRP组中只有31%的患者复发。而PRP组中96%的患者从在头发生长的开始阶段重新长头发，曲安奈德药物治疗组中只有25%患者在头发生长的开始阶段重新长头发[41-42]。现有越来越多的临床试验研究PRP再生及修复的治疗效果，但是仍需更大样本，更长时间随访的临床试验研究来进一步证明PRP的有效性和安全性。

3.2 治疗眼科疾病：干眼症（dry eye disease，DED）是最常见的眼部疾病之一。近年来，由于老年人口、长期面对电子产品的工作人员的增多，同时伴随隐形眼镜的广泛应用都导致干眼症的发生率持续增高[43]。传统的干眼治疗包括人工泪液或者糖皮质激素控制症状，例如眼部灼烧、刺痛和异物感，但是不能修复受损伤的部位。自体血清（autologous serum，AS）已被建议作为重度干眼症的治疗方法。AS中含有EGF、维生素A、IGF、α2-巨球蛋白和促炎细胞因子等，表现出优于人工泪液的优势。而PRP因其含有高浓度血小板和极少量的其他物质，则更优于AS。自体PRP和人工泪液治疗中度至重度干眼对比研究发现，自体PRP组治疗前后的眼表疾病指数和角膜荧光素染色评分比较差异有统计学意义，并且干眼症主观症状评分下降，一个疗程后，自体PRP治疗组的有效率高于对照组，结果显示PRP能够改善中重度干眼症患者眼部不适等症状[43]。在体外培养试验中发现，PRP可以促进猫角膜内皮细胞的增殖能力，呈剂量依赖性[44]。虽然这种经PRP处理后的角膜内皮细胞的生物学性状有待进一步的研究，但是也推动了角膜内皮病变的治疗。

3.3 骨科疾病：PRP因其优良的促进组织细胞再生等优点被广泛应用于骨科的临床治疗。近年来，关于骨关节炎、软骨组织病变和韧带修复等多种疾病均有PRP应用的研究报道。PRP主要的适应症包括骨折、骨缺损、肌腱损伤、创面、关节内软骨损伤和骨关节炎等，还可用于骨髓炎和股骨头坏死的辅助治疗[45]。

骨骼的愈合和重塑是由多种细胞因子参与的过程，主要包括骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs），VEGF，TGF-β，PDGF，FGF和IGF[46]。而含有这些因子的PRP可以加速骨骼的愈合。在体外试验中，PRP可以通过AKT和Notch-1信号通路促进骨髓间充质基质细胞（bone marrow mesenchymal stromal cells，BM-MCSs）的增殖，二者联合应用比单独使用PRP更有效[47]。有研究发现骨髓间充质干细胞经过PRP和磷酸钙粒子处理后Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白和骨钙素的表达升高，促进干细胞向成骨方向分化，加速骨的再生[48]。并且，PRP还可以促进干细胞向肌腱方向分化，加快肌腱的修复[49，50]。除了促进细胞的增殖和分化，体外PRP联合抗炎药物也发挥了重要的作用。肌腱边缘的旋转轴细胞经过白介素1β诱导而处于一种炎性环境，实验组中细胞单独使用抗炎药物-曲安奈德处理后虽然会下调炎性基因但是也会上调退行性基因，而联合使用PRP和曲安奈德的细胞中炎性基因和退行性基因的表达均下降，既发挥了抗炎作用也发挥了抗退化的作用[51]。除了在骨再生和骨关节炎中的应用，在肌腱愈合过程中PRP也发挥着重要作用，一方面刺激细胞外基质的表达，另一方面也促进干细胞向肌腱细胞的分化[52]。在创面及软骨损伤修复过程中，PRP也能起到加速伤口愈合，减轻炎症，缓解疼痛的作用，最终促进了骨与软组织的修复[45]。

4 PRP应用的局限性 虽然体外细胞实验数据支持 PRP具有促进细胞的增殖、分化、细胞外基质合成等作用，但是PRP的临床效益尚未得到普遍实现，各种临床研究结果之间存在异质性，提示我们PRP应用可能存在一定的局限性。患者年龄、PRP的制备、PRP的细胞组成、应用频率和次数、评价方式等多种因素都可能会产生临床异质性[45]。PRP的制备首选成分血单采机制备，但是部分医院仍多采用PRP专用套装制备方法，这种制备方式多样可能也导致PRP制品的质量难以保证。除了制备方式的不统一，PRP自身成分的复杂性和可变性也是导致临床异质性的原因之一。PRP经过冻存-复苏过程后其中细胞因子可能会发生衰减，影响治疗的有效性。如何及时准确的检测PRP中生长因子等活性物质也是其临床应用的难点。PRP中的白细胞浓度取决于PRP的制备方法，关于白细胞的存在对PRP发挥抗炎作用的争论很多，这也是研究者对于PRP安全性的考虑之一。PRP中纤维蛋白的形成有助于修复受损血管壁，防止组织进一步出血，而这种纤维蛋白立体结构的观察目前也没有快速简单的检测方法。因此，PRP的制备方法和其最终成分的异质性都会影响产品应用的功效。除了PRP自身特性之外，患者自体的生理及病理特征也可能影响PRP的效果，因此PRP的应用和适应症应由临床医师根据患者的治疗需求决定。

5 小结与展望 随着血细胞分离技术的快速发展，PRP正成为快速治疗各类疾病的新兴手段。血细胞分离机采集PRP的安全性更高，血小板浓度更稳定，在未来PRP临床应用中覆盖领域会更广。虽然PRP应用研究较多，但是有些研究尚有无效甚至较差的临床疗效，这可能也受限于较少的样本数。因此，对于PRP的定义、操作手段、患者的疗效评估方法等都需要进一步的规范化。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突