代谢组学在畜禽中的研究进展

葛 宇，吾斯曼·吐尼亚孜，陈 余，王 梁，齐晓龙，邢 凯，王相国，肖龙菲，郭 勇，倪和民，盛熙晖*

（1.北京农学院动物科学技术学院，北京 102206；2.北京市畜牧总站，北京 100107）

随着科研技术的不断发展，继基因组学、蛋白质组学之后，代谢组学（Metabonomics）这一新兴技术已逐渐成为研究小分子代谢物的有力工具。有记录表明，古希腊中世纪就有“尿液图表”的广泛使用，将尿液的颜色、气味等情况与医疗领域相结合，此种方法的本质就是根据代谢物来进行疾病诊断[1]。1997 年，Oliver[2]通过定量分析酵母代谢产物评估基因的遗传功能，首次将代谢水平和基因水平联系起来。1999 年，Nicholson等提出代谢组学这一概念，其将生命体看作是一个完整的系统，通过对代谢物定性定量测定，以动态视角研究机体发生的生理变化和病理特征[1]。目前，代谢组学是研究生物体系（细胞、组织或生物体）受外部刺激所产生的所有代谢产物变化的一门科学[3]，其主要研究对象包括糖类、脂类、氨基酸和核苷酸等相对分子质量小于1 000 的小分子内源代谢物。

组学之间相互独立也相互联系，如果说基因组学告诉可能发生什么，那么转录组学和蛋白质组学将会告诉即将发生什么，而代谢组学则会告诉正在发生什么[2]。与其他组学相比，代谢组学具有以下优势：代谢组最接近生物体表型，基因变化引起蛋白质表达改变，最终会在代谢物的水平得到放大；代谢组学研究不需要进行全基因组测序或建立大量表达序列标签的数据库；代谢物的种类远远小于基因和蛋白质；代谢物的分析技术更为通用，不需要考虑物种上的区别[4-5]。在畜禽遗传育种、营养、疾病诊疗等研究上，转录组学、蛋白质组学等可检测到基因与蛋白质的变化，但很难与生物学功能建立直接联系，而代谢组学可以将代谢物与生物表型构建直接相关性。本文对代谢组学常用的分析技术进行了总结和比较，概述了代谢组学在畜禽遗传育种、营养以及动物疾病领域的研究进展，为代谢组学在畜禽动物中的应用提供参考。

1 代谢组学分析技术

代谢组学的主要分析技术是质谱（MS）和核磁共振（NMR）光谱，也有少数研究使用毛细管电泳-质谱技术，这些分析技术各具优势，目前应用最多的是质谱法。

1.1 NMR 技术 NMR 技术是一种原子级的分析方法，利用高磁场中原子核对射频辐射的吸收光谱来对化合物进行鉴定。常用的有氢谱（1H NMR）、碳谱（13C NMR）和磷谱（31P NMR）3 种。NMR 技术在代谢组学的领域中有许多优势，它不需要复杂的样品制备分离过程就可以进行检测，减少对样品的破坏性，能够严格定量生物流体、细胞提取物和组织中丰富的化合物。灵敏度和分辨率是NMR 所面临的主要挑战[6]。针对这一弊端，研究人员做了许多改进工作，如使用同位素标记策略、微线圈核磁共振等。Le 等[7]应用NMR 技术分析鸡的组织和生物流体，在胸肌中仅发现了23 种代谢物；而Xiao 等[8]应用1H NMR 技术对5 个不同日龄的武定鸡肉质进行研究，检测到57 种代谢物。

1.2 色谱-质谱联用技术 代谢物的种类复杂多样，分析技术的高分辨率和高灵敏度是代谢组学研究的有力保障。质谱与气相色谱（GC）或液相色谱（LC）的结合可以分析检测出多种代谢物，是试验检测的强大工具。

1.2.1 气相色谱-质谱技术（GC-MS） GC-MS 是将气相色谱与质谱的优点相结合，即高效分离能力和丰富结构信息融合，适用于分析挥发性或半挥发性的小分子化合物。GC-MS 分析较为稳定，灵敏度高，使用数据库和软件可方便快速地检测代谢物。根据其气质检测的原理，要求被检测的物质具有一定的热稳定性，才可以进行后续的物质气化分离检测。相对核磁共振技术，此种方法在样品制备较为费时费力且难以进行新的化合物鉴定。曾茂茂[9]用GC-MS 检测健康人的血液样本，分析出血浆中氨基酸、糖、脂肪等内源代谢物。刘艳丽等[10]在鸡的原代肝细胞中添加叶酸培养，采用GC-MS 检测到31 个代谢物含量发生显著变化，并发现叶酸可促进鸡原代肝细胞的脂类分解，也可参与糖、脂类及氨基酸的代谢通路。

1.2.2 液相色谱-质谱技术（LC-MS） LC-MS 具有更高的灵敏度，更广泛的代谢物检测范围和多样化的方法，对于物质的性质要求较少，大多数能被离子化的物质都可以使用液质的平台进行分析检测。在近5 年的代谢组学研究中，LC-MS 分析技术的应用已经超过所有检测技术的总和，占到65% 左右[11]。Kim 等[12]应用LC-MS 技术评估酮康唑（KCZ）在小鼠和人类中的代谢谱，共鉴定出28 种代谢物，并首次新发现了咪唑环、哌嗪环和N-乙酰基等11 种代谢物。该研究丰富了对于KCZ 代谢途径的理解，并在药物代谢和药物诱导的毒性之间建立联系。

除此之外，超高性能液相色谱（UPLC）和高分辨率质谱技术在分离度、通量和灵敏性方面更为强大[13]，可以获得1 000 种代谢物的数据。以上几种方法得到的数据会存在一定差异，需要结合样本具体类型和所选模型中重点代谢物的特点选择最理想的检测方法，才能达到理想的试验效果。

2 代谢组学在畜禽中的研究进展

明确解析动物体内的代谢机制，保证畜禽健康与高效生产，是研究者们始终追求的目标。阐明生物体的代谢机制是一个十分复杂的过程，常常因为技术落后而难以达到理想的效果。代谢组学的蓬勃发展不仅缓解了当前技术上的瓶颈，也进一步证实其在畜禽育种、营养、疾病等领域具有巨大的潜力[14]。

2.1 代谢组技术在畜禽育种方面的应用 代谢组技术可以对动物机体的代谢物进行动态的跟踪分析，帮助解析表型与遗传、环境等因素的关系，为经济性状的改良和育种提供表型数据[15]。

目前，研究人员主要应用代谢组技术筛选与畜禽经济性状相关的重要标志物和代谢途径。例如，Wu 等[16]通过测定血清代谢组鉴定与乳蛋白产量相关的关键代谢物，共鉴定出36 个差异代谢物，其中马尿酸、烟酰胺和壬酸是乳蛋白产量的关键代谢物，可作为评测乳蛋白产量的潜在标志物。D'Alessandro 等[17]结合代谢组与蛋白质组方法研究牛肉嫩度的标志代谢物，发现糖酵解酶ENO1、伴侣蛋白HSPA8、和抗氧化酶SOD 的蛋白水平和代谢水平对牛肉嫩度具有较好的预测作用。公牛的繁殖力对生产至关重要，生育能力与精子内的代谢特征关系密切。Menezes 等[18]试验预测γ-氨基丁酸、氨基甲酸酯、苯甲酸、乳酸和棕榈酸可作为公牛生育力的潜在生物标志物；Evans 等[19]在冷冻公牛精子的研究中发现花生四烯酸和油酸与氧化保护过程有关，二者揭示了脂肪酸对精子质量的影响作用，为预测种公牛受精潜力提供基础。Welzenbach 等[20]利用多组学数据解析猪肉滴水损失的功能通路，共注释了126 个代谢物和35 个蛋白质，富集到10 条代谢途径，其中鞘脂代谢和糖酵解作用对猪肉滴水损失具有显著作用。D'Alessandro 等[21]研究卡塞塔纳和大白猪2 个品种的pH、系水力和肉色等肉质参数，发现糖酵解酶水平和乳酸积累与卡瑟塔纳猪的pH 缓慢下降有关，大白猪中丙酮酸激酶1 和原肌凝蛋白的水平与屠宰后24 h 的系水力和肉色有关，甘油3-磷酸和肌酸激酶M 与卡瑟塔纳猪的脂肪形成加重和糖酵解速度减慢有关。

同时，代谢组技术可用于数量性状的遗传参数估计。例如，Nogi 等[22]分析日本黑牛的脂肪酸组成，并与胴体性状进行相关分析，发现油酸、单不饱和脂肪酸与牛肉的大理石花纹呈正相关，表明脂肪品质和胴体性状可以同时进行遗传改良。Lopez 等[23]发现单个脂肪酸浓度的遗传度估计值在0.14～0.45，脂肪、蛋白质和乳糖的遗传力较高，遗传力估计值在0.17～0.41，表明在可以通过选择性育种来满足市场需求。

代谢组技术也可用于动物品种鉴定。Bovo 等[24]靶向检测180 种代谢物，发现多种代谢物在意大利大白猪和意大利杜洛克2 个品种间存在差异，例如乙酰鸟氨酸和鞘磷脂，为研究两个品种猪之间的生物学差异提供了重要的生物标志物。同时，科研人员发现鸡[25]、猪[24,26]、牛[27-28]等动物中不同品种间亦存在着差异代谢物，这些代谢物或可作为品种鉴定的生物标记物。

2.2 代谢组技术在动物营养方面的应用 代谢组技术可以探索营养与代谢的复杂关系，调整最适的营养供给，使动物达到最佳健康状态和生产性能。

代谢组技术在鸡的营养研究中已有若干应用。Beauclercq 等[29]应用代谢组学技术分析鸡血清代谢组，筛选消化效率的代谢标志物，发现脯氨酸、富马酸盐、葡萄糖与氮校正表观代谢能（AMEn）关联最强。姬舒云[30]对艾拔益加肉鸡进行不同水平的苏氨酸饲喂，结果表明NRC 标准的125% 添加组与标准推荐量添加组之间差异最为显著，代谢组分析发现两组间存在6 个差异显著的代谢产物。有研究表明，母鸡饲喂发酵饲料与混合饲料后，赤藓糖醇、苏糖醇和尿素这3 种蛋黄代谢物与12 种血清代谢物含量显著改变，证明饲料会影响卵黄及血清的代谢物，通过控制家禽营养水平或许可以特定改变蛋中的成分[31]。

研究人员应用代谢组技术在牛的营养方面也开展了大量研究。Carrillo[32]团队通过代谢组谱和转录组数据证实，在不同饲喂系统下养殖的肉牛，其生化指标及营养水平均会产生较大差异。Novais 等[33]应用代谢组技术分析牛的血清代谢组，发现视黄醇代谢途径与肉牛饲料转化率存在关联性，表明肉牛饲料转化率与血清代谢组之间可以建立联系，今后可将标志代谢物用于反刍动物饲料转化率的评估。

在猪的营养研究方面，Huntley 等[34]利用代谢组技术研究木糖在猪体的代谢情况，证实D-苏糖醇是木糖的主要尿代谢产物，猪可以代谢木糖，但代谢效率低于与葡萄糖。朱坤等[35]基于超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱的代谢组学技术，探讨猪采食发酵饲料后代谢产物的变化，发现试验组育肥猪血清黄嘌呤、丁子香酚、丙烯酰胺和对香豆酸的含量显著升高，L-焦谷氨酸含量显著降低，表明以上物质对于改善应激作用、减轻自由基对机体的损伤有重要作用。

2.3 代谢组技术在动物疾病方面的应用 在畜禽生产中，疾病会严重影响动物的生长发育，进而降低经济收益。代谢组技术可以捕捉到动物发病前后代谢物含量的变化，在疾病的预防及诊疗方面提供新的方法。目前，代谢组技术主要应用于鸡、牛、猪等经济动物的疾病领域。

Boerboom 等[36]使用非靶向代谢组技术鉴定与肉鸡白条纹肌肉形成有关的生物学途径，发现脂肪酸氧化、三羧酸循环、精氨酸代谢和牛磺酸代谢等代谢途径紊乱导致了肌肉组织缺氧，继而引发肌肉缺陷。Shi 等[37]对肉鸡腹水综合征进行了多组学的研究，发现早期肉鸡腹水综合征主要由甘油磷脂类代谢物氧化引起，二羟基丙酮或可作为低温腹水综合征的潜在标志物，深度解析了肉鸡腹水综合征的发病机理。Liu 等[38]应用代谢组学与蛋白质组学结合的方法研究叶酸对鸡肝脏的影响，鉴定出43 种差异代谢物和63 种差异蛋白，发现添加叶酸后鸡原代肝细胞的抗氧化功能、碳水化合物和氨基酸代谢受到显著影响，初步阐明了叶酸对鸡肝脏的影响机理。

奶牛酮病是生产中的高发病之一，该疾病会严重影响奶牛产奶量及牛场的盈利能力。Zhang 等[39]利用代谢组技术发现奶牛正常健康组、亚临床酮症组及临床酮症组的血浆代谢物存在差异，发现的酮症生物标志物在临床诊断、预后和预防酮症方面具有新的应用和意义。Shahzad 等[40]应用代谢组气相色谱-质谱联用技术和全转录组微阵列研究产前奶牛肝脏代谢组和转录组与奶牛产后酮症的关联，通过差异代谢物和差异基因的挖掘，为奶牛产后酮症的发病机制提供新的思路与方法。Lu等[41]利用非靶向代谢组学和蛋白质组学技术对不同能量平衡状态的泌乳期奶牛乳汁进行检测，发现处于重度负能量平衡的奶牛乳汁中急性期反应蛋白、不饱和脂肪酸和半乳糖含量较高，正常状态的奶牛乳中胆固醇及相关蛋白、胃抑素浓度较高，为评估负能量平衡指标奠定了理论基础。Getty 等[42]将代谢组技术应用于仔猪代谢紊乱研究中，发现精氨酸饲喂改变了仔猪的整体血液代谢物谱，主要涉及与能量、氨基酸、核苷酸和脂质通路相关的代谢物，同时具有对糖代谢等异常代谢的纠正作用。

3 结语与展望

代谢组学自提出至今经历了二十多年的完善与丰富，已经可以应用于植物、疾病诊断、药物设计、食品质检等领域。然而，代谢组学仍存在一些问题亟待解决，如目前的代谢物提取及分析技术无法涵盖所有代谢物，需要针对样品选择最合适的分析及检测平台；其次，代谢组学的数据分析是研究重点，需要利用生物信息学、多元统计学等方法进行挖掘，但目前相关的研究方法不够成熟，仍有待进一步的完善；另外，数据库的局限性也是限制代谢组学发展的主要因素，需要及时完善、更新代谢库的检索功能。

目前代谢组技术在动物上的应用较少，但是随着其技术的日趋臻熟，将会成为畜禽营养、育种和疫病等研究的有力工具。代谢组学的进步也将会推动多组学联合分析的发展，研究方法将从表观整体水平到不同层级的整合分析，对试验对象展开全面研究，从而阐名生物体复杂的调控机制。