幼畜超数排卵及卵母细胞体外成熟的研究进展

郭晓飞，丰雨琪，张金龙，李义海，董春晓，张效生(天津市农业科学院 畜牧兽医研究所，天津市畜禽健康养殖工程中心，天津 300381)

肉类消费市场对畜牧业生产力提升的需求日益迫切，人们对家畜、家禽的肉、奶、蛋和毛皮等性状进行选育与改进。然而，对于一些体型稍大的家畜(如牛、羊、猪等)，其生殖周期、世代间隔等繁殖特点很大程度上阻碍了育种学家们的快速选育与种质改进步伐。包括人工授精、同期发情、超数排卵和胚胎移植等在内的辅助生殖技术(Assisted Reproductive Technology, ART)可以帮助育种学家们突破家畜的自然生殖规律(如季节性发情、发情不集中等)，极大地提高优秀个体的繁育能力，更好的保留和选育优良遗传性状[1]。

幼畜体外胚胎移植(Juvenile in Vitro Embryo Transfer, JIVET)技术即是ART的一种。虽然幼龄母畜其性腺生殖系统还未充分发育完全，但其原始生殖细胞已经存在于卵巢内，且幼畜机体对外源生殖激素的反应较之成年母畜更加敏感；因而，当利用幼畜进行超数排卵时，可产生数量远高于成年母畜的窦状卵泡[2]。经体外成熟培养和受精后，可大量生产胚胎；移植至成年代孕母畜子宫内，能迅速获得数量众多的后代个体[3]。

1 幼畜超数排卵的生理基础

卵巢起源于肾脏器官或中肾的内侧。随着胚胎的发育，原始生殖细胞继续通过有丝分裂进行增殖；然而，由于细胞凋亡的发生，在胎儿出生前原始生殖细胞数量即出现急剧减少[4]。研究表明，在有丝分裂转变为减数分裂时，原始生殖细胞的数量可达到最大值[4]。在人类中，原始生殖细胞最大值时间为胎儿发育的第五个月，约有7×106个原始生殖细胞，而到达出生时只有2×106个仍然存活[5]。小母牛出生前原始生殖细胞最大数量可达2.1×106个，但出生时却仅剩1.3×105个[6]。犊牛在其妊娠约第140天时，原始卵泡开始形成、卵泡募集自此立即开始，并且持续不断地直至耗尽卵巢所有原始生殖细胞，约至妊娠第230天可以识别出卵巢上的第一个窦状卵泡[4]。

出生4～8周后的羔羊，其卵巢重量是其刚出生时的6～8倍，而之后的12～33周的卵巢质量却显著下降；且窦状卵泡由出生时的(935±208)个增加至4周龄的(1100±185)个，而12周龄的窦状卵泡急剧下降至(287±99)个[7]。Tassell等[8]指出4周龄羔羊卵巢窦状卵泡出现明显的闭锁现象，并在8～10周龄时卵巢上的闭锁卵泡数量继续增加。在性成熟后，窦状卵泡可在促性腺激素的刺激下继续发育、排卵，从而避免了闭锁的命运。然而，在8周龄前，羔羊垂体和血浆中的促卵泡生成素(FSH)和促黄体生成素(LH)的浓度较低，且随着周龄的增加未能表现出显著提升；同时，卵巢所分泌的孕酮和雌二醇与其卵泡发育无显著关联[8]。该周龄阶段的卵巢内分泌调节机制虽不健全，但其对促性腺激素的刺激较为敏感[3]。通过补充外源促性腺激素，可使这一时期即将闭锁的卵泡迅速发育，并能获得比成年母畜更可观的超排效果。如Morton等[9]以3～6周龄羔羊为处理对象，使用苯甲酸雌二醇、孕酮栓塞、PMSG和FSH组成的外源激素用药方案，可使羔羊卵巢在外科腹部手术条件下，收集大量卵泡(118.2±29.2)和卵母细胞(82.0 ±24.2)。此外，为评估外源激素和外科手术处理对羔羊青春期发情启动和繁殖力的影响，Valasi等[10]利用1月龄的羔羊，经每月一次的激素刺激和外科手术操作(4个月内，4次腹腔镜法收集卵母细胞)，得出幼年期的激素和手术处理对羔羊后期的内分泌和生殖状态并未造成明显伤害。Currin等[11]以2～6月龄的犊牛为研究对象，也证实了多次(4个月内，8次腹腔镜法收集卵母细胞)超数排卵以及卵母细胞收集对犊牛是安全可控的，且成年后可正常怀孕繁殖。

2 幼畜的超数排卵效果及优化方案

幼畜超数排卵的激素给药方案基本是根据成年母羊的促性腺激素刺激方案(多次注射FSH或者单次注射eCG)而制定的。由于羔羊体重偏小，其比成年母羊所接受促性腺激素的剂量也会更少。Valasi等[12]指出，依据羔羊体重调节FSH注射剂量(0.27 mg/kg)所获得卵母细胞数量和质量明显优于统一FSH注射剂量(3.52 mg /羔羊)。Fang等[13]通过在羔羊左耳皮下埋置18 mg褪黑激素缓释后，再进行超数排卵(FSH/12h×2d+PMSG)时发现，与对照组相比可明显提高>2 mm直径卵泡数量(106±14.9_VS_79.4±9.22)和卵母细胞数量(86.3±7.77_VS_55.2±4.29)。Currin等[11]在犊牛超数排卵研究中，认为72 h长时效FSH刺激方案(6次×12 h间隔)所获得的>5 mm直径卵泡比率(34.0%_VS_11.2%)、优质卵丘-卵母细胞(CoCs)比率(95.3±18%_VS_ 85.4±22%)和囊胚率(36.7±26%_VS_18.3±15%)均显著优于36 h短时效刺激方案(3次×12 h间隔)。

除了激素刺激方案的差别，幼龄动物的日龄也是影响其超数排卵效果的重要因素。Valasi等[12]采用相同的激素处理方案(2×P4+FSH/12 h×3 d)指出：2月龄和5月龄羔羊供体的卵母细胞成熟能力相近，但3至4月龄的羔羊供体的卵母细胞成熟能力非常差。Mao等[14]采用PMSG处理后得出，5～8周龄的羔羊超数排卵后，其可获得的卵母细胞数量(108. 50±17. 68)远远高于10周龄羔羊(42.0±11.3)。Baldassarre等[15]利用FSH配合eCG处理方案刺激青春期前的山羊时，发现60～90日龄的山羊供体，超排后可获得卵母细胞数量为(49.7±24)个，极显著高于90～150日龄山羊供体所能提供的(34.4±20)个卵母细胞数量。

青春期前幼畜对超排激素的敏感性还存在着巨大的个体差异，目前已报道的数据显示，约有27%～72%的羔羊个体对超排激素的应答效果不甚理想(低于5个卵泡)[16]。因此，若能提前预知羔羊卵巢的超排反应效果，不仅关系到动物福利，也可避免不必要的手术伤害。Valasi等[17]提出，根据手术收集卵母细胞前12 h的雌二醇浓度，可以协助排除超排效果较差(≤1个卵泡)和中等(2～5个卵泡)的羔羊个体，并据此可避免对低敏感羔羊的重复手术和激素处理。

不论何种激素处理方案，青春期前幼畜卵母细胞体外发育的能力均比成年动物低。相比于成年母畜，幼年母畜超排后卵泡内的卵泡液微环境、卵丘细胞状态、卵母细胞的细胞质和细胞核成熟等各方面的均有所差异 。

3 幼畜与成年卵母细胞体外成熟比较

3.1 幼畜与成年卵泡液微环境的比较

卵泡液的主要成分包括碳水化合物、脂肪酸、多肽、激素和生长因子等，是卵母细胞在体内生长和成熟的主要微环境[18-19]。虽然，尚不完全了解卵泡液中的各个成分能在多大程度上影响卵母细胞的成熟过程；但已有研究表明，幼年和成年母畜中卵泡液的组成差异较大[20-23]。比如，青春期前犊牛卵泡液所含葡萄糖和脂肪滴等的浓度要显著低于成年母牛[20，22]。在绵羊中，Wu等[23]通过iTRAQ蛋白质组学分析发现，有243种蛋白质在1月龄羔羊与成年母羊卵泡液中差异表达。上述幼龄和成年母畜卵泡液微环境的差异，可能部分解释了幼畜卵母细胞成熟和发育能力低的原因。

Tian等[24]报道，在羔羊卵母细胞成熟培养基中添加成年母羊的卵泡液，可改善羔羊卵母细胞生产胚胎的囊胚率。但在成年卵母细胞成熟过程中添加其卵泡液，囊胚率并未得到显著提升，即成年母羊卵泡液中可能包含羔羊卵泡液所不存在的重要刺激因子，并且羔羊卵母细胞对这些刺激因子能做出有效应答。Pawlak等[25]在仔猪卵母细胞成熟培养基中添加成年母猪的卵泡液时，结果也具有提高囊胚率的相似功效。但是，成年母畜卵母细胞体外成熟过程中，不论是否添加了任何来源的卵泡液，其成熟过程似乎不受影响；即成年母畜卵母细胞在其相应卵泡中可能已经达到了完整的发育能力，从而在体外培养过程中对常规培养基的要求不再苛刻。

3.2 幼畜与成年的卵丘细胞差异

卵丘细胞是通过精巧的间隙连接以参与卵母细胞成熟过程的[26]。卵丘细胞的主要作用表现在：(1)可使卵母细胞维持在减数分裂停滞状态，(2)参与诱导卵母细胞恢复减数分裂，(3)为卵母细胞的胞质成熟提供条件。Haenisch-Woehl等曾在光学显微镜下发现，与成年犬相比，青春期前的犬卵丘细胞的细胞核凸显，并只拥有很少量的细胞质[37]。Fang等[13]通过皮下埋置褪黑激素再进行羔羊超数排卵时发现，凋亡性卵丘细胞比例更低、卵丘细胞的DNA甲基化染色信号更强。Fang等[28]再次报道了褪黑激素可上调卵丘细胞上的核结合位点基因RORα、抗氧化相关基因(SOD1、GPx4、CAT)和与卵丘细胞扩张相关基因(PTX3、HAS2、PTGS2)等的mRNA表达水平，并能显著降低卵丘细胞的氧化应激、抑制细胞的凋亡。综上，羔羊卵母细胞外围的卵丘细胞扩张率、凋亡率、氧化应激状态及相关基因表达水平，可以作为衡量羔羊卵母细胞体外成熟的重要指标。

3.3 细胞质与细胞核成熟

在小鼠的研究中，Eppig等[29]发现随着卵母细胞直径从65 μm增加到80 μm，其正常发育和成熟的能力逐步提高；即卵母细胞生长的最后阶段发生的细胞质或细胞核变化对于卵母细胞最后成熟至关重要。通过核移植等试验研究表明，小鼠的卵母细胞的细胞核和细胞质成熟均在此阶段发挥了重要作用[16，30]。因此，细胞质或细胞核成熟一度成为幼畜卵母细胞体外培养的研究热点。

21世纪前，关于幼龄反刍动物卵母细胞生产的胚胎发育停滞问题，学者们多数归因于其卵母细胞的细胞质各方面的缺陷或不成熟[31-33]。上述推测主要考虑到，青春期前的犊牛和羔羊卵母细胞直径通常比成年母畜的卵母细胞直径小[34]。Anguita等[35]在青春期山羊研究中也显示，卵母细胞发育能力与卵母细胞直径和卵母细胞形态密切相关。在超微结构观察中，成年母猪卵母细胞成熟后，表现为MⅡ期的正常到来、卵丘细胞与卵母细胞接触的缺失、粗面内质网和高尔基体的消失以及线粒体和脂滴排列位置的集中化；而至于青春期前的仔猪卵母细胞超微结构上的情况则多种多样。较大体积的仔猪卵母细胞与成年母猪卵母细胞差异相对较少，但较小体积的仔猪卵母细胞其超微结构上的线粒体总数明显较少(线粒体密度基本一致)，且分布位置更加弥散。Pedersen等[36]由此认为，卵母细胞质中的线粒体数量决定了青春期前仔猪卵母细胞的体外成熟能力。

线粒体作为细胞质能量供应来源的主要细胞器，已被证明与卵母细胞发育能力息息相关，其数量和功能状态可影响受精过程和胚胎发育[37-39]。尤其表现在卵母细胞成熟过程中，线粒体合成的ATP对于蛋白质合成和磷酸化修饰的重要作用[40]。Leoni等[41]指出羔羊(30～40日龄)卵母细胞成熟至MⅠ期的时间比成年母羊卵母细胞晚1小时，其细胞内ATP增长时间被延迟且未达到成年卵母细胞水平；共聚焦扫描显微镜观察显示MⅡ期的羔羊卵母细胞具有活性的线粒体是均匀分布的，相反，成年卵母细胞是聚集成簇出现的。Leoni等[42]还报道羔羊卵母细胞质中有7个基因(Na+K+ATPase、p34cdc2、Glut-1、Activin、PanZO2、PAP和E-Cad)的mRNA表达量丰度显著低于成年卵母细胞。

卵母细胞质中的微管对于其减数分裂至关重要，它参与减数分裂纺锤体的形成和染色体的运动，并且其生理作用受到翻译后修饰的调控。Serra等[43]通过荧光染色研究了青春期前羔羊和成年母羊体外成熟过程中的微管翻译后修饰，发现成年母羊卵母细胞内的微管蛋白乙酰化和酪氨酸化水平相当；而在羔羊卵母细胞中，微管蛋白乙酰化水平却显著高于酪氨酸化水平。这一结果暗示着，相较与成年卵母细胞，处于MⅡ期的羔羊卵母细胞的微管惰性更强，不利于纺锤体活跃与染色体的拖动 。

在卵泡生成的过程中，卵母细胞逐渐获得了减数分裂的能力，伴随着染色质的结构变化和细胞核内基因的表达沉默调控；特定启动子区域的局部染色质修饰和单拷贝基因的顺式作用调控元件，以及整个基因组大规模的染色质重塑，均在这一过程中发挥重要作用[44-45]。核内DNA甲基化是卵母细胞减数分裂过程中染色体进行正确配对的前提条件，且表观遗传成熟也是卵母细胞获得减数分裂及其后续发育潜能的重要标志[46-48]。Ptak等[16]还发现来自羔羊卵母细胞胚胎的发育停滞发生率很高，进一步检测显示其卵母细胞全基因组甲基化也较低。Fang等[49]通过比较4周龄羔羊和2.5岁成年母羊的超数排卵和体外胚胎生产研究发现，羔羊卵母细胞成熟率(77.97% vs 92.16%)和胚胎卵裂率(59.19% vs 82.98%)均大大低于成年母羊。随着卵母细胞的体外成熟与受精，不论其来自羔羊还是成年母羊，细胞核DNA的5mC和5hmC染色信号均逐渐增强，即胚胎的形成和发育伴随着DNA甲基化水平的加强；但相比于成年母羊，羔羊卵母细胞成熟和胚胎发育各个阶段的5mC和5hmC的染色信号强度均更低，且各阶段的DNA甲基化转移酶(Dnmt1，Dnmt3a和Tet3)mRNA的表达水平也表现为羔羊显著低于成年母羊。据此推测，较少的甲基转移酶导致的低DNA甲基化水平，可能引起羔羊卵母细胞和早期胚胎发育潜能的降低。而Cocero等[45]从较大月龄的羔羊(3月龄)和成年母羊卵巢表面直径大于3mm的窦状卵泡中获取GV期卵母细胞时，发现两类卵母细胞GV期DNA甲基化水平以及二者的成熟能力相当，但在最终胚胎囊胚率指标上，3月龄羔羊来源的卵母细胞仍然显著低于成年卵母细胞。综上所述，细胞质成熟和细胞核成熟均参与了幼畜卵母细胞的体外成熟过程。

4 幼畜卵母细胞体外成熟方案的优化

目前，用于幼畜卵母细胞体外成熟的培养基基本与成年母畜的一致；但幼畜卵母细胞体外生产的胚胎发育能力要显著低于成年母畜，这表明传统的体外成熟液并不完全适应于幼畜卵母细胞体外培养以及随后的胚胎发育[24]。Byskov等[50]曾在人类卵泡液中分离出一种可促使小鼠卵母细胞减数分裂恢复的固醇类物质，被称为卵泡液减数分裂激活固醇(FF-MAS)。经研究，AY9944 A-7可通过抑制Δ14还原酶的活性来诱导FF-MAS的积累[51]。因此，Hao等[52]通过在体外培养基中添加AY9944 A-7来改善羔羊卵母细胞培养条件，结果显示AY9944 A-7不仅可以促进自然状态下的羔羊卵母细胞成熟，同时还可以改善次黄嘌呤抑制下的卵母细胞成熟，并对二细胞期发育至囊胚期也有提升作用。

还原型谷胱甘肽(GSH)在卵母细胞发育过程中可保护其免受氧化损伤、参与减数分裂纺锤体形成和染色质的缩聚。据报道，伴随着卵母细胞成熟，细胞中GSH含量也随之增加；且体内成熟的卵母细胞比体外成熟的卵母细胞含有更多的GSH[53]。Kochhar等[54]通过蛋白放射标记显示，相比于羔羊而言，成年卵母细胞中含有更高浓度的蛋氨酸和半胱氨酸(合成GSH的重要蛋白质)。Bai等[53]通过在体外培养基中添加2-巯基乙醇和半胱氨酸来增加培养体系中的GSH浓度，结果并未提高羔羊卵母细胞的成熟率，即来源于自身成熟过程中的GSH积累才是体外培养及后续受精和胚胎发育的关键；但其所添加的2-巯基乙醇和半胱氨酸可改善精子的染色质解凝和原核形成，从而一定程度上提高了卵母细胞受精率。de Matos等[55]以PMSG处理成年(8周龄)和青春期前小鼠(24～26日龄)，并在48 h后从卵巢中取出卵母细胞用于体外胚胎生产；与对照组相比，添加半胱氨酸盐组的成年小鼠来源胚胎发育均能得到改善，但并不能改善青春期前的小鼠来源胚胎。由此推测，青春期前卵丘-卵母细胞复合体(CoCs)在谷胱甘肽合成能力方面存在的不足，也可能成为导致体外胚胎生产效果不佳的原因。

乙酰基左旋肉碱参与线粒体中的脂肪酸氧化和能量代谢，可运输游离脂肪酸至线粒体内膜上，能调节细胞氧化应激并参与细胞凋亡等重要细胞活动[56]。在小鼠、猪和牛的卵母细胞体外成熟研究中表明，添加左旋肉碱可有效提高体外胚胎卵裂率或囊胚率[57-58]。Reader等[59]在体外培养羔羊卵母细胞添加乙酰基左旋肉碱后，发现卵母细胞质和生发泡体积显著增大，且改变了卵母细胞的脂滴分布，最终使囊胚率由4.6%增加至10.0%。褪黑激素作为抗氧化物质除自身可清除机体的ROS外，还能刺激某些抗氧化酶的活性，以降低细胞内的氧化应激水平。Fang等[28，60-61]和Soto-Heras等分别以幼年绵羊和山羊为研究对象，筛选出添加10-7浓度的褪黑激素可有效清除卵母细胞ROS水平，增加了卵母细胞的线粒体活性和ATP含量，提高了卵丘细胞的扩张率、降低了卵丘细胞的凋亡率。

考虑到来自同一幼畜的卵母细胞的质量可能是高度异质的，不同幼畜个体中获取的卵母细胞状态也可能不一致。研究者们认为，通过药物暂时性阻断卵母细胞自发性核成熟，在体外延长减数分裂可改善核成熟与胞质成熟之间的同步性[62-65]。这样可保证卵母细胞有充足时间经历结构和生理变化，并有助于处于不同阶段GV期的卵母细胞同步化，从而改善卵母细胞体外成熟效率。如Wang等[65]研究发现，在经过13 μM亮甲酚蓝着色后的羔羊来源的卵母细胞囊胚率显著高于未着色组(37.03%_VS_6.28%)；未着色组中，在体外成熟液中添加75 μM浓度甲氰吡酮，处理6 h后可有效改善后续的囊胚率。分析认为，甲氰吡酮一定程度上抑制卵母细胞发育，致使卵内cAMP水平累积保持卵母细胞停滞在GV期；最终为细胞核和细胞质同时成熟提供合适的条件。

5 总 结

相比于成年母畜，幼年母畜卵巢具备提供更多卵母细胞的生理基础与潜能。然而，幼畜来源卵母细胞在后续体外成熟、胚胎卵裂率和囊胚率方面表现不佳。综合已有报道显示，卵泡液微环境、卵丘细胞氧化应激或凋亡情况、卵母细胞体积、线粒体数量和微管蛋白修饰以及细胞核内DNA甲基化水平等均能影响幼畜卵母细胞的发育竞争能力。结合以上因素及目前体外成熟优化方案研究进展，凡有助于CoCs内GSH合成、线粒体氧化应激缓解、胞质和核内成熟物质积累的添加物，均有可能改善现有的幼畜卵母细胞体外培养系统。