m6A甲基化修饰与消化道恶性肿瘤关系的研究进展

张璐瑶，汪丽钰，陈乾，时建明

(南京医科大学姑苏学院 南京医科大学附属苏州医院 苏州市立医院肿瘤内科，江苏 苏州 215008)

恶性肿瘤是一种全身性的基因性疾病，在内因及外因的共同作用下，正常细胞发生一系列基因突变，机体内肿瘤细胞过度增殖导致肿瘤形成[1]。早在20世纪70年代，N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenine，m6A)甲基化修饰已被发现[2-4]，其是最普遍的RNA分子表观遗传修饰，但由于检测技术的限制，m6A甲基化修饰的具体功能及作用机制仍不明确。有证据表明，m6A甲基化修饰在信使RNA(messenger RNA，mRNA)前体剪接、3′端加工、核输出、翻译调控、mRNA降解和微RNA加工中起关键作用[5]。m6A甲基化修饰调控紊乱可能影响mRNA的加工、降解以及翻译过程，导致癌基因的激活及抑癌基因的失活，与恶性肿瘤的发生、发展以及耐药的发生密切相关，因此m6A甲基化修饰迅速成为国内外研究的热点之一。

目前，恶性肿瘤已进入精准治疗时代，但消化道恶性肿瘤的治疗手段仍较局限，尤其是缺乏靶向治疗、免疫治疗的有效治疗靶点和生物标志物，且患者5年生存率仍较低。现对m6A甲基化修饰与消化道恶性肿瘤的相关研究进展予以综述，旨在为判断肿瘤预后、寻求逆转肿瘤放化疗抗性和分子靶向治疗的新策略提供新的线索。

1 m6A甲基化的概述

1.1m6A甲基化相关概念 据RNA修饰通路数据库统计，截至2017年底，已在所有已知生物体中发现了约163种RNA化学修饰[6]。在这些化学修饰中，m6A甲基化修饰最普遍、丰度最高、最保守[2,7]，在最简单的细菌以及复杂动物的几乎所有类型的RNA中均存在m6A甲基化修饰。m6A甲基化修饰作为一种极其重要的RNA修饰，可调节关键的细胞过程，包括肿瘤干细胞更新以及细胞增殖、分化、对脱氧核糖核酸损伤的反应等[8]，一旦相关细胞过程失调，则导致疾病发生，尤其是恶性肿瘤。

1.2m6A甲基化修饰相关酶 m6A甲基化修饰过程可逆，且有多种酶(腺苷甲基转移酶、去甲基化酶和RNA结合蛋白)参与，此类酶可促进、去除和识别m6A甲基化修饰位点，并传递m6A甲基化修饰信号至多个生物学过程[9]。参与m6A甲基化修饰的酶的异常，将导致一系列疾病(恶性肿瘤、血液系统疾病、神经性疾病、肥胖、不孕、胚胎发育迟缓等)的发生[10-11]。参与m6A甲基化修饰的酶包括①腺苷甲基转移酶，又称写入复合物，主要由甲基转移酶样蛋白(methyltransferase like protein，METTL)3[12]、METTL14[13]、RNA结合基序蛋白15/15B[14]、肾母细胞瘤1关联蛋白[15]和vir-like甲基化转移酶相关蛋白[16]组成，其中METTL3为催化核心，肾母细胞瘤1关联蛋白为催化亚基，METTL14作为结构支持，以稳定METTL3-METTL14核心复合物，而RNA结合基序蛋白15/15B有助于将复合物募集到靶点，但目前对写入复合物中vir-like甲基化转移酶相关蛋白的作用尚未完全了解[17]。②去甲基化酶，又称去除复合物，包括肥胖相关蛋白(fat mass and obesity-associated protein，FTO)[18]和烷基化修复同系物5(alkylation repair homolog 5，ALKBH5)[19]，它们能够通过氧化作用选择性地去除含m6A底物中的甲基，从而调节基因表达和细胞分化，使RNA甲基化成为一种可逆的动态调节反应。③读取复合物，包括YT521-B同源(YT521-B homologous，YTH)结构域蛋白[20]、真核起始因子3[14]、人胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白家族[21]和核不均一核糖核蛋白家族[22]，它们可以选择性地识别mRNA的m6A位点，并参与下游翻译，提高mRNA出核速度并介导mRNA的降解等[23]。

1.3m6A甲基化的检测方法 在各种功能性RNA分子中存在大量的核苷酸修饰，其中最常见的内部修饰包括m6A、N1-腺苷酸甲基化、5-甲基胞嘧啶等[24]。因此，特定位置RNA修饰的检测十分必要，对后续鉴定影响RNA修饰的条件以及筛选负责修饰的相关基因和酶有关键作用。随着高通量测序技术的出现，目前m6A甲基化检测方法飞速发展。经典的检测技术主要有m6A甲基化RNA免疫共沉淀测序法[25-26]，它是应用抗原抗体相结合的方法，利用m6A特异性抗体与带有m6A的mRNA片段的结合、富集、纯化进行高通量测序，该方法操作简单、快速方便，仅能鉴定mRNA上m6A甲基化程度较高的区域，并且仅能将m6A定位在100～200 nt长度，无法获得单个碱基甲基化水平。随后，m6A单核苷酸紫外交联免疫共沉淀测序法出现[27]，该方法利用特异性抗体诱导逆转录过程中的突变和截断，从而鉴定单个核苷酸水平的甲基化修饰，但该方法涉及紫外交联及P32同位素标记，操作更加复杂，成本较高，故日常实验室中的应用相对较少。

基于以上两种方法的局限性，目前m6A甲基化检测新方法的研究仍在进行。RNA修饰后核酸双链体熔解特性发生改变，Golovina等[28]利用高分辨率熔解曲线分析并快速筛选出RNA中发生m6A甲基化修饰的特异性位点，该方法是一种简单、快速、低成本的聚合酶链反应扩增后检测技术。此外，中山大学骆观正教授团队与美国芝加哥大学何川教授领导团队合作开发了一种新型m6A甲基化水平鉴定方法，称为m6A敏感性RNA内切酶测序法，该方法突破了大样本量的限制，且不需要依赖特异性抗原，仅通过特异性RNA内切酶——毒素蛋白MazF，就能实现对m6A甲基化水平的检测，且能够精确到单碱基分辨率水平[29]。毒素蛋白MazF检测RNA底物灵敏度、特异度均较高，在样本量非常有限的前提下也能发挥作用，且实验设计快速简化，不需要抗体富集，大大缩短了样品制备时间，在很大程度上扩大了m6A甲基化修饰的研究范围。

2 m6A甲基化修饰与消化道肿瘤的关系

随着m6A检测方法的不断优化，m6A的相关研究范围也不断扩大。最近的研究已经证明，m6A甲基化修饰与多种消化道恶性肿瘤密切相关，如胃癌[30]、结直肠癌[31]、肝细胞癌[32]、胰腺癌[33]、食管癌[34]等，其相关修饰酶可作为癌基因或抑癌基因在恶性肿瘤的增殖[35]、分化、发生[36]、侵袭[36]和转移[37]中起关键作用。

m6A甲基化修饰涉及多种修饰酶的作用，它们是调节癌变和肿瘤进展的主要因素。然而，由于恶性肿瘤的高度异质性，不同修饰酶在不同肿瘤中存在双重作用(抑制或促进肿瘤生长)。当m6A调控基因改变或与m6A甲基化相关酶的表达变化时，m6A靶向基因mRNA的水平将发生变化，从而导致恶性肿瘤的发生发展。通过系统性的回顾可了解m6A甲基化修饰对不同类型消化道肿瘤的调控作用。

2.1m6A甲基化修饰与胃癌 胃癌是第五大恶性肿瘤，据统计，2018年全球新发胃癌病例超过100万，死亡约78.3万[38]。近年来，胃癌病死率有所下降，但由于大多数患者确诊时已为晚期，临床治疗效果较差。因此，胃癌发病的分子机制和治疗靶标仍需进一步探索。

通过基因集富集系统性地分析m6A在胃癌中的生物学功能发现，写入复合物以及读取复合物是潜在的肿瘤抑制信号，而去除复合物则是胃癌的致癌信号。其中，可通过敲除METTL14的表达降低m6A水平激活Wnt和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号转导通路，以促进胃癌细胞的增殖和侵袭，而通过敲除FTO表达增加m6A甲基化修饰则会逆转分子信号通路，达到相反的效果[30]。然而，作为腺苷甲基转移酶之一的METTL3基因则具有致癌作用，敲除METTL3基因可以降低B细胞淋巴瘤-2的表达，增加B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白和胱天蛋白酶3的活性，促进肿瘤细胞凋亡。此外，下调METTL3的表达可导致磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号通路失活，从而抑制胃癌细胞的增殖和迁移[39]。由此可见，METTL3和METTL14均属于腺苷甲基转移酶，但在胃癌中的作用却相反，这可能由肿瘤微环境的复杂性和高度的肿瘤异质性所致，还值得进一步探究。

2.2m6A甲基化修饰与结直肠癌 结直肠癌是全球高发的消化道恶性肿瘤之一，2018年全球结直肠癌新发病例超过180万，死亡88.1万[38]。由于多数结直肠癌患者就诊时已为晚期，且疾病进展快、易发生远处转移，因此需要进行广泛深入的研究以提高结直肠癌的诊断和治疗水平，并预测其复发风险。

Zhang等[31]研究发现，肾母细胞瘤1关联蛋白与碳酸酐酶Ⅳ相关，其通过靶向肾母细胞瘤1结合蛋白-肾母细胞瘤1-转导素β样蛋白1轴抑制Wnt信号传导，抑制肿瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡和细胞周期停滞。Deng等[40]研究发现，METTL3阳性表达与较长的存活时间显著相关，且METTL3过表达可抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，而METTL3下调则显示出相反结果。此外，METTL3的下调可导致磷酸化-p38抗体和磷酸化-胞外信号调节激酶的活化，p38或胞外信号调节激酶抑制剂可以显著逆转METTL3基因敲除所诱导的迁移和侵袭。故推测，METTL3可能通过p38/胞外信号调节激酶通路抑制结直肠癌的增殖、迁移和侵袭，因此，可将METTL3作为结直肠癌发生、发展新的标志物。Liu等[41]分别对结肠腺癌标本及直肠腺癌标本进行细化研究发现，在结肠腺癌标本中，与正常组织相比，除METTL14、YTHDF3下调外，其他所有写入复合物及读取复合物均显著上调；而直肠腺癌标本与正常组织中的肾母细胞瘤1关联蛋白、METTL16、核不均一核糖核蛋白C、YTHDC1比较差异无统计学意义。Yang等[42]的研究证实，结肠腺癌和直肠腺癌标本中去除复合物ALKBH5的表达均明显弱于正常组织，但两者中FTO的表达比较差异无统计学意义。Liu等[41]进一步通过单因素Cox回归分析发现，TNM分期及高METTL3表达是结肠癌无复发生存期的重要预后因素，TNM分期和年龄是总生存期的预后因素，而TNM分期是直肠癌无复发生存期的唯一预后因素，年龄、TNM分期以及METTL14、METTL16和ALKBH5的表达对总生存期有重要影响；进一步的多因素Cox回归分析显示，TNM分期是结肠癌患者总生存期的独立危险因素，而METTL14、ALKBH5的表达以及TNM分期是直肠癌患者总生存期的独立危险因素。可见，m6A相关基因表达失调在结直肠癌进展中发挥重要作用，有望成为判断结直肠癌患者预后的临床生物标志物。

2.3m6A甲基化修饰与肝细胞癌 肝癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，据统计，全球每年新发肝癌病例约84.1万，死亡约78.2万[38]。目前肝癌的发病原因已明确，尤其在亚洲地区，乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒是肝癌发生发展的主要危险因素。由于多数患者就诊时已为中晚期，且处于肝硬化失代偿状态，治疗效果欠佳。因此，从分子机制层面了解肝细胞癌发生、发展对于推进诊断、治疗及判断预后至关重要。

通过综合性分析m6A甲基化修饰相关酶在人类肝癌中的表达，Zhou等[32]发现，肝癌组织中的METTL3、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3和真核起始因子3均上调，且METTL3和YTHDF1是肝癌的独立不良预后因素，均可调节肝癌细胞周期、RNA剪接、DNA复制、碱基切除修复和RNA降解。进一步从分子机制层面分析发现，METTL3可促进肿瘤抑制基因细胞因子信号转导抑制因子2 mRNA 3′端的m6A甲基化修饰，从而通过YTHDF2依赖机制促进细胞因子信号转导抑制因子2 mRNA的降解，敲除METTL3的表达可以显著降低肝癌细胞的增殖、迁移和集落形成[43]。此外，METTL14同样作为腺苷甲基转移酶，其下调是肝细胞癌无复发生存期的不良预后因素之一，下调METTL14可以减弱miR-126的表达，从而促进肝癌转移[37]。综上分析，不同m6A 写入复合物可能在肝癌进展过程中起致癌(或抑癌)作用，METTL14作为肝癌的抑癌基因，与其他m6A写入复合物的作用相反，这可能与肝癌细胞的异质性有关，仍需进一步研究。通过比较分析不同肝细胞癌患者的癌组织和正常组织发现，肝细胞癌细胞核中去甲基化酶FTO表达降低，且与AFP水平、肿瘤大小、远处转移和脉管浸润相关，FTO表达降低患者的总生存期和无瘤生存期相对缩短[44]。在分子机制上，FTO通过M2型丙酮酸激酶的去甲基化，促进翻译产物产生，而敲除FTO基因表达可以抑制肿瘤增殖和体内生长，诱导肝癌细胞G0/G1期阻滞[45]，表明FTO可能是肝细胞癌患者预后不良的重要预测因子。

2.4m6A甲基化修饰与胰腺癌 胰腺癌恶性程度较高，尽管多学科综合治疗不断发展，但胰腺癌发现时往往已为晚期，患者的预后仍较差。因此，探索m6A甲基化修饰在胰腺癌中的机制至关重要。Xia等[33]对40例胰腺癌患者进行系统性研究发现，METTL3高表达患者分期相对偏晚、淋巴结转移数量较多、生存率偏低，且与癌旁组织相比，肿瘤组织标本中的METTL3蛋白和mRNA水平明显增高；敲除METTL3基因表达减少mRNA m6A甲基化修饰后，癌细胞增殖、侵袭和迁移减弱。因此，METTL3可能与胰腺癌发生有关，并可能作为胰腺癌预后指标或治疗靶点应用于后续治疗中。

去除复合物(如ALKBH5)也是胰腺癌总生存率的重要预测因子之一，ALKBH5高表达患者的总生存期相对较长，说明其对胰腺癌的发生、发展具有积极作用[46]。此外，Tang等[47]发现，通过吉西他滨建立的人源肿瘤组织异种移植模型的去甲基化酶ALKBH5表达下调，而沉默ALKBH5能显著增加胰腺癌细胞在体内外的增殖、迁移和侵袭，而ALKBH5过度表达则导致相反的结果。由此可见，腺苷甲基转移酶高表达以及去甲基化酶低表达均在胰腺癌中占关键地位，而读取复合物在胰腺癌中的作用仍有待研究。

2.5m6A甲基化修饰与食管癌 食管癌是最具侵袭性的恶性肿瘤之一，发病率位居全球恶性肿瘤的第七位，死亡率位居全球恶性肿瘤的第六位[38]。Yang等[34]分析食管癌鳞癌组织与邻近正常组织的差异发现，肿瘤组织中YTHDC2表达下调，并通过细胞增殖实验发现，敲除YTHDC2基因可促进细胞生长，而YTHDC2过表达时效果则相反，说明YTHDC2在食管鳞癌中发挥抑癌基因的作用；同时该研究从分子机制层面观察到一些重要的癌症相关通路被激活，包括p53、核因子κB、Janus激酶/信号转导及转录激活因子等信号通路。进一步对生存曲线的分析发现，ALKBH5、YTHDF2和METTL14的高表达与食管癌患者生存期延长呈正相关，而核内不均一核糖核蛋白C和WTAP的高表达则与总生存期呈负相关[48]，表明m6A 甲基化修饰相关酶在食管癌发生发展过程中起重要作用，有望成为预测食管癌预后的重要分子标志物。

3 m6A甲基化修饰与消化道肿瘤的治疗

m6A甲基化修饰受到写入复合物(METTL3、METTL14、WATP等)、读取复合物(YTH结构域蛋白、核不均一核糖核蛋白蛋白家族)和去除复合物(FTO、ALKBH5等)的调节，上述组成基因表达的变化将引起mRNA表达水平的改变，从而导致肿瘤的发生、发展、侵袭。因此，m6A甲基化修饰的相关调节剂或抑制剂可能是恶性肿瘤的潜在治疗策略。

在靶向治疗方面，碳酸酐酶Ⅳ可通过靶向肾母细胞瘤1结合蛋白-肾母细胞瘤1-转导素β样蛋白1轴抑制Wnt信号转导，进而抑制结肠癌患者肿瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡和细胞周期停滞[31]。METTL3通过p38/ERK通路抑制结直肠癌的增殖、迁移和侵袭[40]。此外，Huang等[49]研究发现了一种高度选择性的FTO抑制剂——甲氯芬酸(一种非甾体抗炎药)，其可与FTO结合位点竞争结合，增加m6A甲基化修饰，从而抑制肿瘤进展。

在化放疗方面，去甲基酶ALKBH5过表达可提高胰腺癌细胞对化疗的敏感性[47]。而敲除胰腺癌细胞株METTL3基因表达的患者对吉西他滨、5-氟尿嘧啶和顺铂等抗肿瘤药物以及放疗的敏感性较高，提示METTL3是提高胰腺癌疗效的有效靶点[50]。在食管癌中，METTL3表达与食管癌复发有关，提示METTL3过表达可能是食管癌患者铂类药物耐药的关键因素，因此调节METTL3的表达可能是提高铂类药物疗效的新方法[51]。

在免疫调节方面，通过敲除FTO基因表达可增加肿瘤细胞免疫治疗敏感性[52]。Li等[53]发现，mRNA m6A甲基化修饰通过靶向白细胞介素-7/信号转导及转录激活因子5/细胞因子信号转导抑制因子通路调控T细胞稳态，m6A甲基化修饰相关酶作为T细胞分化的关键调节因子，在肿瘤免疫系统调控及肿瘤生长和播散中发挥重要作用。

4 展 望

近年来，随着m6A甲基化修饰检测技术的发展，关于m6A甲基化修饰及其相关酶在肿瘤中作用的研究已经取得实质性进展。m6A甲基化修饰是一把“双刃剑”，一些基因的过度修饰可能改变RNA剪接和翻译能力，导致恶性肿瘤的发生发展，而有些基因在缺乏m6A甲基化修饰时，可能导致肿瘤发生。由于肿瘤的异质性，相同写入复合物、去除复合物、读取复合物在不同肿瘤中的作用亦不同，可表现为癌基因或抑癌基因，但均通过蛋白质表达的失调引发或促进肿瘤进展，这为肿瘤的治疗指明了方向。针对m6A甲基化修饰的相关酶在肿瘤发生、发展中的调控机制仍需深入探索，未来关于m6A甲基化修饰功能的研究将有重大突破，其中恢复m6A甲基化的理想水平是治疗的关键，更多m6A甲基化修饰相关酶的调节剂和竞争性拮抗剂的发现，对精准、有效的m6A靶向药物的研发具有重要意义。