ER-α36介导乳腺癌中曲妥珠单抗耐药的新机制

骆艺，黄剑

(1.广东医科大学，广东 湛江 524023；2.广东医科大学附属医院病理诊断与研究中心，广东 湛江 524000)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，存在高度异质性，而肿瘤异质性是导致肿瘤耐药和治疗失败的内在因素。近年来，乳腺癌发病率逐年升高并呈年轻化趋势。据国际癌症研究机构统计，乳腺癌已超越肺癌成为世界上最常见的癌症[1-2]。根据组织学特征，其可分为激素受体阳性乳腺癌、人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)阳性乳腺癌和三阴性乳腺癌。HER2阳性乳腺癌占全部乳腺癌的15%～20%，复发率和转移率较高，患者的生存时间短、预后较差[3-6]。乳腺癌的治疗主要包括内分泌治疗、抗HER2靶向治疗和化疗。其中，曲妥珠单抗是靶向治疗HER2阳性乳腺癌的一线药物，效果较好[7]。但曲妥珠单抗抗HER2治疗最终会发生耐药[8-9]。在曲妥珠单抗耐药的患者中，30%～40%的患者雌激素受体(estrogen receptor，ER)水平较高，ER与HER2相互作用会促进乳腺癌细胞增殖，并引起内分泌治疗耐药[6,10-11]。ER-α36是ER-α66的剪切变异体，其与HER2及其相关信号分子可能发生物理性相互作用，导致HER2信号通路的活化和耐药。现就ER-α36的结构、功能及引起曲妥珠单抗耐药的可能机制予以综述，以为今后临床克服曲妥珠单抗耐药提供新思路。

1 ER-α36与曲妥珠单抗

1.1ER-α36

1.1.1ER-α36的结构 ER-α36由Wang等[12]发现，分子量为36 000。ER-α36缺乏转录激活域，但保留了DNA结合域以及部分ER-α66的二聚体和配体结合区域。ER-α36主要在质膜和细胞质表达，其C端具有的独特的27个氨基酸序列可替代ER-α66基因外显子7和8编码的C端的138个氨基酸，ER-α36还具有3个潜在的酰基化位点[13-14]。ER-α36从ER-α66基因的第1个内含子中的启动子开始编码，转录后可形成特异性ER-α36蛋白，该蛋白参与ER的多条信号转导途径。

1.1.2ER-α36的功能 ER-α36为膜型ER，在ER-α66阴性和阳性乳腺癌细胞中均有表达，尤其是在缺乏ER-α66、ER-α46和ER-β的ER阴性乳腺癌细胞中高表达[15]。乳腺癌细胞的转移以及对他莫昔芬的耐药均与ER-α36的表达相关，应用他莫昔芬治疗ER-α66阳性且ER-α36高表达的乳腺癌无效[16]。研究发现，ER-α36在具有高侵袭性、高复发风险和预后更差的三阴性乳腺癌中也高表达[15,17]。表明ER-α36可促进乳腺癌细胞的增殖，并与乳腺癌的发展及预后密切相关。

1.2曲妥珠单抗 曲妥珠单抗是首个获得美国食品药品管理局批准的治疗HER2阳性乳腺癌的药物，是一种针对HER2胞外结构域的重组DNA衍生的人源化单克隆抗体，可通过与癌细胞膜上的HER2结合，阻止HER2二聚化，阻断下游信号转导，抑制癌细胞增殖；还可触发宿主免疫系统攻击和杀死曲妥珠单抗结合的肿瘤细胞，这种免疫反应称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用，始于自然杀伤细胞上的FCγ受体与曲妥珠单抗的Fc部分结合[18-19]。HER2阳性乳腺癌患者的预后不良、死亡率较高，并可在短时间复发且转移率高。临床研究表明，抗HER2的重组单克隆抗体曲妥珠单抗能显著延长HER2阳性乳腺癌患者的无病生存期和无进展生存期；除紫杉醇和多西他赛外，曲妥珠单抗是HER2阳性转移性乳腺癌的标准一线治疗药物[5,9,20]。曲妥珠单抗用于转移性和早期乳腺癌的治疗，从根本上改善了HER2阳性乳腺癌的预后[21]。而应用曲妥珠单抗后，约70%的患者会出现原发性或获得性耐药，但耐药机制尚未完全阐明，可能的耐药机制包括HER家族成员间形成二聚体，磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)信号通路过度激活，人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因的突变或丢失，其他受体酪氨酸激酶(如胰岛素样生长因子1受体和肝细胞生长因子受体c)活性的上调[22]。

在15%～20%的HER2阳性乳腺癌中，有50%～60%也表达ER；在HER2和ER均阳性的乳腺癌中，随着肿瘤细胞ER表达的增加，曲妥珠单抗的疗效逐渐降低，提示曲妥珠单抗耐药可能与HER2和ER之间的相互作用以及激活新的信号通路有关[23-24]，但具体机制尚不明确。ER-α36是近年新发现的膜型ER，下调ER-α36的表达可降低三阴性人乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力[25]。研究发现，ER-α36与表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)/HER2存在正向调节作用[26-29]，提示ER-α36过表达可激活HER2及下游信号通路，这可能是曲妥珠单抗耐药的新机制。综上可知，针对ER-α36的靶向治疗可能为克服曲妥珠单抗耐药提供新思路。

2 ER-α36参与HER2阳性乳腺癌曲妥珠单抗耐药的机制

2.1ER-α36通过快速雌激素信号通路参与HER2耐药 HER2是受体酪氨酸激酶HER(也称为ErbB)家族成员。ErbB家族包括4个成员：ErbB1(EGFR、HER1)、ErbB2(HER2)、ErbB3(HER3)和ErbB4(HER4)。ErbB作为非活性单体在细胞膜表面表达，在配体存在的情况下，受体酪氨酸激酶发生同源或异源二聚体化，导致构象改变，促进细胞内HER家族的自磷酸化[30]。配体诱导的构象改变可引起C端酪氨酸残基的自磷酸化，使Src结构域介导蛋白质之间相互作用，从而使信号通过PI3K-Akt通路转导。HER2缺乏细胞外配体，除形成同源二聚体外，还可与ErbB家族的其他成员以及其他受体酪氨酸激酶形成异源二聚体[6,30]。激活的HER2同源和异源二聚体调控着一个复杂的下游信号网络，该网络调节细胞的存活和转移。HER2主要与HER3形成异源二聚体，该二聚体被认为是HER2介导致癌功能的主要信号实体，可诱导下游不同的促生存和致瘤途径，包括PI3K-Akt和促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路[31]。

曲妥珠单抗的耐药机制包括已存在或新出现的替代信号转导途径，这些信号转导途径提供补偿信号以抵消和克服HER2靶向治疗的抑制作用，其中最主要的信号转导途径为ER信号转导途径。ER通过提供可替代的增殖和存活信号，重新表达、激活HER2阻断的通路，从而起到代偿性逃避途径的作用[32-33]。然而经典ER蛋白主要定位于细胞核，HER2主要定位于细胞膜，因此理论上它们之间存在物理性相互作用的可能性较小，由此可推测与HER2发生作用的是定位于细胞质和质膜的ER蛋白剪切变异体ER-α36蛋白。与传统的ER-α和ER-β不同，ER-α36主要在细胞膜和细胞质中表达，虽然缺乏内在转录能力，但可介导与胰岛素样生长因子1受体、EGFR和HER2等相关的快速雌激素信号转导通路。快速雌激素信号转导通路即非基因组信号转导通路，也称为核外或膜启动信号通路，由多种生长因子及其相应受体共同参与[25-26]，包括腺苷酸环化酶通路、蛋白激酶C通路、G蛋白偶联受体激活通路、PI3K-Akt和MAPK信号通路、Ca2+通路和Src激酶激活的信号通路等[34-35]。这些快速反应通路的相互作用可提高细胞内Ca2+水平，调节基因转录，诱导细胞周期失调，然后通过调节不同的下游信号通路导致细胞异常增殖和分化，其与抗雌激素药物的耐药密切相关[12,31,36]。PI3K-Akt信号通路在多种肿瘤的发展过程中起调控作用，其通过突变获得或丧失某些功能而解除调控，激活乳腺癌中的致癌通路，并与细胞转化和肿瘤发生相关[37]。已知PI3K-Akt信号通路的结构性激活与HER2耐药有关，且目前普遍认为PI3K-Akt及MAPK-胞外信号调节激酶信号通路的过度激活是曲妥珠单抗耐药的主要机制之一[33]，提示ER-α36介导的快速雌激素信号通路与曲妥珠单抗的耐药存在关联。

2.2ER-α36通过与EGFR/HER2形成正向调控介导曲妥珠单抗耐药 在乳腺癌中，膜相关的ER-α36的激活伴随EGFR的反式激活，EGFR的反式激活诱导快速激酶级联反应，从而影响细胞的增殖和存活[38]。ER-α36与EGFR共表达，形成一个正调控环，可激活ER-α36基因启动子上的转录因子激活蛋白1，导致ER-α36基因转录，调节ER-α36与EGFR在肿瘤细胞中的表达，从而促进肿瘤细胞的恶性生长；ER-α36亦可通过与EGFR/原癌基因酪氨酸蛋白激酶SRC/衔接蛋白Shc复合物相互作用，加强EGFR信号通路的作用，还可通过衔接蛋白Shc/EGFR/信号转导及转录激活因子5途径介导雌激素诱导的细胞周期蛋白D1启动子的激活，从而导致三阴性乳腺癌细胞增殖增加[28,34,39-40]。采用小干扰RNA敲除ER-α36后，乳腺癌细胞中的HER2和EGFR表达均减少；采用EGFR酪氨酸激酶抑制剂AG1478(4-(3-氯苯胺基)-6，7-二甲氧哇哇琳)、EGFR和HER2双酪氨酸激酶抑制剂拉帕替尼或MAPK/胞外信号调节激酶抑制剂U0126(1,4-二氨基-2,3-二氰基-1,4-双(2-氨基苯硫基)丁二烯)均可有效下调乳腺癌细胞中ER-α36的表达；敲低乳腺癌细胞中ER-α36的表达，亦可减少HER2和EGFR的表达，同时减少EGFR/原癌基因酪氨酸蛋白激酶SRC/衔接蛋白Shc复合物，阻滞PI3K/Akt及MAPK/胞外信号调节激酶信号通路，并恢复HER2阳性乳腺癌细胞对曲妥珠单抗的敏感性[27,41]。综上可知，ER-α36与EGFR/HER2之间存在阳性调控循环，其可激活PI3K/Akt及MAPK/胞外信号调节激酶信号通路，调节肿瘤细胞的恶性生长，并介导曲妥珠单抗耐药。

2.3ER-α36通过影响乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells，BCSCs)调控曲妥珠单抗敏感性 1994年，肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)首先在急性髓系白血病中被发现，其是肿瘤细胞的一个子集，通常占肿瘤细胞的1%～5%(在乳腺癌中可高达11%～35%)，是一种具有遗传或获得性干细胞样特征的癌细胞，尽管出现频率不高，但参与肿瘤发展的所有阶段，包括原发肿瘤的发生、发展、转移和复发[42]。CSCs可通过增加外排转运蛋白和抗凋亡蛋白的表达或抵抗电离辐射而产生耐药性，是治疗后复发和增加不良预后风险的潜在因素[43]。CSCs模型表明，具有相似遗传背景的肿瘤细胞可根据其致瘤潜力进行分层，而CSCs位于层级结构的顶端，在大部分肿瘤中CSCs拥有肿瘤启动和转移能力[44]。

与野生型乳腺癌细胞MCF-7相比，CD44在MCF-7肿瘤干细胞子集中的表达上调，并与其主要配体透明质酸结合，激活多种信号通路，引起细胞增殖、黏附、迁移和侵袭[45]。聚集的肿瘤细胞丰富表达BCSCs标志物CD44，促进肿瘤的形成和多克隆转移；而CD44的缺失有效阻止了肿瘤细胞的聚集，降低p21蛋白-激活激酶2水平[46]。以上研究提示，乳腺癌可能起源于具有自我更新能力的BCSCs，其特征为CD44high/CD24low表型和乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)1活性与其他CSCs类似，BCSCs具有自我更新和分化、保持休眠/静止以及逃避免疫系统清除的能力[47]。ALDH亚型、CD44和CD29表达的上调提示BCSCs的富集性。BCSCs以两种状态存在，即上皮样细胞(如具有高ALDH活性的细胞)和间充质样细胞，其特征为CD24低表达、CD44高表达，上皮-间充质转化和可逆性间充质-上皮转变揭示了BCSCs的转移潜能。CD24-、CD44+的间充质样BCSCs主要处于静止状态，定位于肿瘤表面；而上皮样BCSCs表达ALDH，增殖旺盛，位于肿瘤中心。与其他肿瘤干细胞不同，BCSCs的可塑性使其能够进行上皮-间充质转化，也可进行可逆的间充质-上皮转化，使乳腺癌细胞在转移部位具有侵袭、扩散和生长的能力[48]。目前认为，ALDH是人类BCSCs的标志物。ALDH与ER阳性乳腺癌的耐药相关[49]，且ALDH的高水平和活性与乳腺癌患者治疗后不良临床结局直接相关，而ER-α36的表达与ALDH1呈正相关，ER-α36的减少可降低ALDH1高活性细胞的生长速度和比例，表明ER-α36有助于干细胞样细胞的维持和增殖[47,49]。在ER阳性乳腺癌细胞中，通过使用短发夹RNA敲低ER-α36的表达，可减少ER阳性BCSCs中快速雌激素信号的转导，并显著降低BCSCs的百分比，表明ER-α36可通过快速雌激素信号转导通路对BCSCs的增殖产生影响[35]。曲妥珠单抗的获得性耐药与肿瘤干细胞数量的增加相关[50]，可通过靶向ER-α36抑制BCSCs生长，从而影响曲妥珠单抗的敏感性。靶向ER-α36在预防HER2阳性乳腺癌转移、降低耐药和复发风险方面前景广泛，深入了解ER-α36蛋白及BCSCs生物学和关键信号通路，对明确HER2阳性乳腺癌对曲妥珠单抗靶向治疗耐药的机制至关重要。

3 小 结

为改善肿瘤患者的预后需要对肿瘤的潜在发病机制进行更深入的研究。经过学者们多年的不懈努力，乳腺癌的研究取得了一系列有价值的进展。ER-α36作为膜型ER，介导快速雌激素信号转导通路，可与HER2相互作用，促进BCSCs增殖，进而促进乳腺癌的发生、发展和耐药。长期以来，对HER2阳性乳腺癌患者的靶向治疗目标是延长患者无病生存期和无进展生存期、改善预后，然而其主要靶向治疗药物曲妥珠单抗耐药已成为临床面临的巨大问题。未来，进一步阐明ER-α36的作用和参与的主要信号通路及过程，可为HER2阳性乳腺癌产生曲妥珠单抗耐药的潜在机制提供新见解，为HER2阳性乳腺癌的治疗提供新方向和靶点。