关于“烟草花叶病毒的感染和重建实验”的几个疑惑点探析*

盛国跃 （浙江省金华市教育教学研究中心 浙江金华 321017）

烟草花叶病毒的感染和重建实验，是证明核酸是遗传物质的证据链中关键的一环。学生在学习时，经常会对该实验中的几个操作产生疑惑。其原因有2 个：其一，在经全国中小学教材审定委员会2004年及2019年初审通过的各个版本的高中生物学教材对这一实验的介绍都很少，例如，人教版教材只是简单说明了实验的结论，苏教版教材只以“知识海洋”的方式作了简介，浙科版教材虽然对该实验的着墨相对较多，但也基本未提及具体的操作过程；其二，与生物学教学相关的期刊中，此方面的相关论文也极少。本文以浙科版教材为例对学生经常产生的3 个疑惑点进行探析。

1 使烟草花叶病毒感染烟草的操作方法

1.1 疑惑：如何进行烟草花叶病毒感染烟草的操作

在浙科版高中生物学教材中多次提及“感染”操作，例如，“用RNA 和蛋白质分别去感染烟草”“分别来自不同病毒株系的RNA 和蛋白质混合后感染烟草”等［1］。但教材中并未提及“感染”的具体操作方法，在其他章节中也未出现可供参考的内容，这让许多学生对此产生疑惑。

1.2 探索：从原始文献中寻找答案

疑惑的价值在于激发学生探索的欲望，并指引学生完成探索过程。文献检索是解决来源于科学史的疑惑的有效方法之一。为了解决这一疑惑，学生在教师的引导下进行了2 个阶段的文献检索。第1 阶段的检索过程如下：①在中国知网中以“烟草花叶病毒”为关键词，以中等教育（各类各科教学法、教学参考书、辅导用书）为范围，进行检索，共检索到38 篇相关文献，但这些文献均不能解决这一疑惑；②以“烟草花叶病毒”为关键词，在中国知网中扩大范围进行检索，检索到的部分文献中指出可通过摩擦接种的方法使烟草花叶病毒感染烟草。然而这一阶段的检索结果并未使全体学生信服，因为，部分学生认为科学研究在一定程度上依赖当时的科技水平，现代的操作技术在Fraenkel-Conrat H.、Williams R.C.等科学家所处的时代不一定适用。想要了解科学家在当时进行改实验时的操作方法，就必须查阅他们关于此实验最初发表的文献。基于此展开第2 阶段的检索过程如下：①在中国知网、国家科技图书文献中心等网站中进行Fraenkel-Conrat H.、Williams R.C.等科学家的姓名检索，未检索到相关文献。②利用联合计算机图书馆中心 （Online Computer Library Center，OCLC） 进行科学家姓名检索，检索到了“Recons－titution of active tobacco mosaic virus from Its inactive protein and nucleic acid components”“Virus reconstitution：Ⅱ.Combination of protein and nucleic acid from different strains”等2 篇原始论文。这2 篇论文证实了“烟草花叶病毒的感染和重建实验”中采用是摩擦接种的方法（注：下文中疑惑点的探索过程与该探索过程基本相同，故在下文中不再赘述）。

1.3 解析：感染操作采用常规的摩擦接种法

烟草花叶病毒有很多类型，不同类型的侵染方式不同，但它们都无特殊的吸附结构，故只能以被动方式侵入，例如，借助昆虫的刺吸式口器或植物天然伤口侵入。其中TMV 可通过相邻叶片摩擦形成的轻微伤口侵入。在自然条件下被烟草花叶病毒侵染后的种子、叶片等是主要侵染源。烟株发生感染的主要时期是苗期至现蕾期，此时烟株抵抗烟草花叶病的能力弱，易感病。在本实验中，使烟草花叶病毒感染烟草的常规方法是摩擦接种。具体的操作是选取生长期、长势相同的烟草若干，在叶片表面喷洒金刚砂，用刷子蘸取病毒液轻轻摩擦，重复几次［2］。接种后需用清水轻轻冲洗叶片叶面，以利于植株发病。由于TMV 发病最适温度为25～27℃，当温度高于38℃后，病毒会受到高温的抑制，因此，实验应在20～30℃温室内进行。

2 将烟草花叶病毒的RNA 与蛋白质相互分离的操作方法

2.1 疑惑：如何人为地将烟草花叶病毒的RNA与蛋白质相互分离

浙科版教材在“烟草花叶病毒（a、b）及其对叶子细胞的感染和病毒重建（c）”示意图中标出，通过“降解”的方法将TMV 的RNA 与蛋白质相互分离，但没有写明其降解的具体方法。受酶解法除去植物细胞的细胞壁等知识的影响，多数学生错误地认为在该实验中也是用酶解法进行“降解”的。

2.2 解析：用石碳酸处理或碱性洗涤剂处理可使烟草花叶病毒的RNA 与蛋白质相互分离

Gierer 和Schramm 在进行烟草花叶病毒的感染实验时，采用将TMV 置于水和苯酚（石碳酸）中，而将蛋白质和RNA 相互分离（图1）。其基本操作是将TMV 溶液与苯酚的水溶液混合，并将此液配制成含有3%十二烷基硫酸钠（SDS）和0.3 mol／L NaAc 的溶液。在4℃下剧烈振荡，离心后取水相，即可得到TMV 的RNA［2］。

图1 将TMV 置于水和苯酚中震荡［3］

Fraenkel-Conrat H.和Williams R.C.在进行烟草花叶病毒的重建实验时，采用先将TMV 用弱碱性洗涤剂处理，然后通过分别提纯的方法将TMV的RNA 和蛋白质相互分离。其基本的操作是，在3℃条件下，将TMV 溶液置于pH 值为10～10.5 的甘氨酸缓冲液或pH 值为10.5 的碳酸氢盐缓冲液中透析48～72 h。用冷超速离心法分离除去未降解的病毒，用硫酸铵将上清液调至pH 值为0.4 的饱和液并再次离心。离心后TMV 的蛋白质主要存在于沉淀中，而RNA 主要存在于上清液中。对蛋白质部分进行重新溶解，经在低硫酸铵浓度下沉淀、透析等操作后可获得纯度高、重组效果好的TMV 的蛋白质［4-5］。

从经碱降解的TMV 中提取的核酸组分，其重组效果不如用洗涤剂法提取的核酸组分。洗涤剂法提取核酸的基本操作是，将含有1% SDS 的病毒溶液的pH 值调整为8.5，并在40℃下保持16～20 h。用硫酸铵使蛋白质沉淀后，取上清液。将上清液冷藏、离心，并用冷乙醇和pH 值为5 的乙酸盐进一步纯化。可获得重建效果好的TMV 的RNA。

3 将提纯后的RNA 和蛋白质体外重建的操作方法

3.1 疑惑：如何实现烟草花叶病毒的体外重建

在浙科版教材中，关于烟草花叶病毒重建操作的相关表述只有一句：“来自不同病毒株系的RNA和蛋白质混合后感染烟草”［1］。至于RNA 和蛋白质应该在什么样的环境中进行混合，混合后又应置于什么样的环境中等问题都没有说明。这就容易导致学生简单的认为只要病毒的核酸和蛋白质在细胞外相遇即可自发重建，不需要特殊处理。

3.2 解析：体外重建效果受pH 值和离子强度等因素的影响

TMV结构简单，是一种典型的棒状植物病毒，约由2 130 个相同的蛋白亚基沿着单链RNA 螺旋状而成，有较强的自组装特性。体外重建的效果受pH值和离子强度等因素的影响。Fraenkel-Conrat H.和Williams R.C.在进行重建活性病毒时的基本操作是，将1%蛋白质溶液与0.1%核酸溶液按一定比例混合，并添加适当的缓冲液，使样品呈现乳白色。pH 值为6 的醋酸盐作为缓冲剂的效果最好，但磷酸盐（pH 值为6.3 或7.0）和乙酸铵（pH 值为6）也可使用。将样品置于3℃环境下保存24 h 后，进行超速离心，除去不可溶物质，获得乳白色上清液。即可从乳白色上清液中获得有活性的重组病毒［4-5］。用电子显微镜观察，发现在重建过程中最初形成的是圆盘状，带有中心孔的蛋白质聚集体（图2），最终形成的重组烟草花叶病毒的形态与正常TMV 相同，但短片段比例较大（图3）。

图2 重组过程中初始形成的蛋白质聚集体（120 000×）［4］

图3 重组烟草花叶病毒颗粒（60 000×）［4］

4 小结

受限于课程的性质、文本的篇幅等因素，高中生物学教材不可能对各种生物学知识都加以详尽的介绍。学生在学习过程中也难免会出现一些困惑，教师应积极引导学生解决困惑。查阅科学家最初发表的相关研究论文是解决困惑的有效方法之一，在帮助学生解决困惑的同时，帮助学生理解“科学知识可能随着研究的深入而改变”“科学受到社会和文化的影响”等科学本质。获得原始文献的途径主要有：馆际文献资源共享库，例如，华东地区西文生物医学期刊联目数据库、联合计算机图书馆中心；中外文期刊数据库，例如，中国知网；国内、外著名图书情报机构、文献服务部门，例如，美国衣阿华大学医学图书馆检索系统（handin MD），http://www.lib.uiowa.edu/hardin-www hslibs.html 提供美国各州、加拿大及部分英国、德国医学院校和医院图书馆网址和免费医学杂志网址，均可方便地查询所需信息；协会组织和出版机构的站点，例如，亚洲桥医学信息快递站。