高效液相色谱-串联质谱法测定龙血碣药材中苏丹红Ⅳ

李柯，杨蕾，孟令嘉

（首都医科大学附属北京世纪坛医院，北京 100038）

龙血竭为百合科植物剑叶龙血树［Dracaena cochinchinensis(Lour.)S.C.Chen］的含脂木材经提取得到的树脂，主要产于东南亚国家和我国云南等地，具有活血散瘀、止血止痛、敛疮生肌的作用，主要用于外伤出血，跌打损伤等症状［1-3］。目前对龙血竭药材的研究主要有龙血竭的化学成分［4］、高效液相色谱指纹图谱［5］、有效成分含量测定［6-8］及部分非法染色［9］。文献报道称有部分不法商家为了商品的外观色泽鲜亮，在龙血竭中掺杂非法染色剂，对人们的用药安全产生一定的危害，文献报道的龙血竭药材中主要检出苏丹红系列和808猩红等染料［9］，苏丹红系列是一种人工合成的偶氮型燃料［10-12］，其代谢产物产生的苯胺和萘胺具有较强的致癌作用，欧美国家已经明确禁止将苏丹红添加至食品与药品中。目前对苏丹红的研究主要为食品中非法添加的检测［13］，苏丹红的测定方法主要有薄层色谱法［14］、紫外分光光度法［15］、液相色谱法［16］、气相色谱串联质谱法［17］和液相色谱串联质谱法［18-19］等。笔者参考文献资料和中国药典［20-21］对10批不同来源的龙血竭药材非法染色进行研究，通过紫外光谱、液相色谱串联质谱进行鉴别和确认，比目前现有文献报道方法更全面，从定性到到定量，并对检出的苏丹红Ⅳ进行含量测定的方法学验证，为龙血竭药材中非法染色的鉴别和苏丹红Ⅳ的含量测定提供实验依据，进而可以更加全面的评价龙血竭药材的质量，从而保证其临床用药的安全性和有效性。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相串联质谱仪：Agilent1260-G6410型，MassHunter采集软件，包括四元洗脱泵，DAD检测器，美国安捷伦仪器公司。

双频数控超声波清洗器：KQ-700VDB型，江苏昆山超声仪器公司。

电子天平：BSA-124S型，感量为0.1 mg，德国赛多利斯公司。

苏丹红Ⅳ：纯度（质量分数）为94.0%，批号为40121，德国Dr Ehrenstorfer GmbH公司。

乙腈：色谱级，美国Fisher公司。

氮气：纯度（体积分数）不小于99.999%，北京天昊气体有限公司。

实验用水为超纯水。

实验所用其它试剂均为分析纯。

龙血碣药材分别来源于云南西双版纳、广西桂林、贵州铜仁、缅甸、泰国等东南亚地区，所有药材购自河北安国中药材市场，药材信息见表1。

表1 药材的样品信息

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱

Agilent-C18XDB色 谱 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美国安捷伦科技有限公司），流动相：乙腈-0.02%甲酸溶液（体积比为95∶5），流量为1.0 mL／min；柱温：30 ℃；检测波长：518 nm；进样体积：10 μL；理论塔板数苏丹红Ⅳ峰计算不低于15 000。苏丹红Ⅳ对照品和伪品龙血竭以及龙血竭药材的色谱图分别见图1、图2、图3。

图1 苏丹红Ⅳ对照品色谱图

图2 伪品龙血竭色谱图

图3 龙血竭药材色谱图

1.2.2 质谱

采用三重四级杆质谱仪进行测定；ESI离子源；正离子模式扫描；干燥气和雾化气：氮气，压力为137.9 KPa（20 psi），流量为 3.0 mL／min；加热气：空气；干燥气体温度：300℃；毛细管电压：3.5 kV；质量扫描范围：50～500 u；多反应监测(MRM)模式；碰撞能量：30 eV；裂解电压：110 V；苏丹红Ⅳ的一级质谱和二级质谱图见图4、图5。

图4 苏丹红Ⅳ对照品的一级质谱和二级质谱碎片图

图5 伪品龙血竭样品的一级质谱和二级质谱碎片图

1.3 溶液的配制

1.3.1 对照品溶液的制备

精密称取苏丹红Ⅳ对照品7.50 mg置于50 mL量瓶中，加乙腈溶解定容至标线，摇匀，作为对照品储备溶液。精密吸取上述苏丹红Ⅳ对照品储备液5 mL置于25 mL量瓶中，加乙腈稀释至标线，摇匀，配制成苏丹红Ⅳ质量浓度为30 μg／mL的对照品溶液。

1.3.2 供试品溶液的制备

精密称取上述批号200101的疑似染色龙血竭药材粉末0.2 g，加乙腈25 mL，超声处理10 min，静置，放凉，采用0.22 μm的微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2 结果与讨论

2.1 苏丹红Ⅳ的鉴别与确认

实验首先取10批龙血竭药材，按照2020年版《中国药典》四部色素指导原则进行薄层色谱鉴别，结果发现有2批样品在与苏丹红Ⅳ薄层色谱相同的位置上显相同颜色的斑点，但是斑点均在前沿，无法准确判断，然后将2批染色可疑的样品再次换展开剂进行展开，使其在较好的比移值范围内，并增加其它系列苏丹红染色剂从而更加准确地判断，结果发现苏丹红Ⅳ确实与1号和5号样品颜色一致。接着采用液相色谱法进行判断，供试品与苏丹红Ⅳ在相同的保留时间出现相同的色谱峰。然后通过紫外光谱图比较，液相色谱串联质谱进行确认和佐证，光谱图中供试品和苏丹红Ⅳ对照品均在518 nm处有最大吸收，且曲线的性状基本一致，质谱佐证实验中的m／z381.9 ［M+H］为苏丹红Ⅳ的准分子离子峰，二级碎片离子分别为m／z223.8、208.0、142.4、90.7 四个碎片离子，且5号和10号两批样品的质谱二级碎片图与苏丹红Ⅳ标准品一致，因此更加确定此2批龙血竭药材进行了苏丹红Ⅳ的染色。

2.2 提取溶剂和色谱条件的选择

苏丹红Ⅳ易溶于笨、油脂和苯酚等极性较小的溶剂中，难溶于水，微溶与乙醇。目前主要有乙腈、正己烷和丙酮等溶剂进行提取的报道，食品中苏丹红的检测方法也是采用正己烷进行处理，以丙酮定容后进行测定，因此本实验对乙腈、正己烷和丙酮三种溶剂进行考察，发现乙腈提取色谱峰形较好，且乙腈比正己烷和丙酮毒性低，因此选择乙腈为提取溶剂。同时本实验参考文献报道和食品中苏丹红检测的国标方法，分别采用乙腈和水、乙腈和0.1%甲酸水溶液以及甲醇和0.1%甲酸水溶液作为流动相进行考察。结果发现乙腈和水溶液作为流动相，对照品的色谱峰有点拖尾；甲醇和0.1%水溶液作为流动相，苏丹红Ⅳ的出峰时间太长，峰形较宽；最后采用乙腈和0.1%甲酸水溶液时，色谱峰形对称，基线平稳，理论塔板数高。采用DAD检测器对苏丹红Ⅳ提取光谱图，结果发现其在518 nm下具有最大吸收，故本实验最终确定乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相，检测波长为518 nm，对苏丹红Ⅳ进行检测。

2.3 线性关系与检出限

取“1.3.1”项下的对照品储备溶液作为对照品5号溶液，采用逐级稀释法，制成含苏丹红Ⅳ分别 为 1.142、3.807、12.69、42.3、141 μg ／mL 的 系列对照品工作溶液，分别作为1～5号对照品溶液，然后精密吸取上述1～5号对照品溶液各10 μL，按照1.2仪器工作条件进行测定，以苏丹红Ⅳ的质量浓度（μg／mL）为横坐标，相对应的色谱峰面积为纵坐标进行线性回归，计算得苏丹红Ⅳ的质量浓度在1.142～141.0 μg／mL范围内线性方程为y=53.237x-13.628，相关系数 r=0.999 9。

将1号对照品溶液进行稀释进样，当S／N=3时为检出限，得到苏丹红Ⅳ的检出限为2.28 ng／mL。

2.4 精密度试验

取同一批号200101的疑似染色的龙血竭药材，按照1.3.2法同时制备6份供试品溶液，然后按照1.2仪器工作条件进行测定。6份供试品中苏丹红Ⅳ含量测定值分别为 2.750 4、2.747 9、2.746 3、2.755 8、2.805 1、2.708 5 mg／g，平均值为 2.752 3 mg／g，计算得测定结果的相对标准偏差为1.12%，表明该方法具有良好的精密度。

2.5 稳定性试验

取同一批号200101疑似染色的龙血竭药材，按照“1.3.2”法制备供试品溶液，连续考察24 h，分别在 0、1、2、4、8、12、24 h 按照 1.2 仪器工作条件进行测定，记录色谱峰面积分别为1 147.2、1 146.1、1 127.1、1 156.3、1 168.7、1 165.2、1 182.9 mAU，平均值为1156.2 mAU，计算得测定结果的相对标准偏差为1.57%，表明该供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.6 回收试验

精密称取同一批号200101疑似染色的龙血竭药材0.1 g，共18份，每6份为一组，然后分别向上述3组样品中精密加入1.3.1配制的苏丹红Ⅳ对照品储备溶液 100、200、300 μL，按照 1.3.2制备供试品溶液，在1.2仪器工作条件下进行测定，结果见表2。样品加标色谱图见图6。由表2可知，样品加标回收率为94.72%～99.21%，说明该方法具有较高的准确度。

表2 加标回收试验结果（n=9）

图6 样品加标回收色谱图

3 结语

首先按2020年版《中国药典》四部色素指导原则进行薄层色谱鉴别，结果发现10批不同产地的龙血竭药材中有2批药材疑似是进行了苏丹红IV的非法染色，且2批龙血竭药材薄层色谱均与其它批次药材斑点不一致，推测可能是其它树脂类药材直接进行染色冒充正品龙血竭药材。采用高效液相色谱串联质谱法对疑似染色的两批药材中苏丹红IV进行确认和测定，并进行方法学研究，稳定性、重复性和回收率均符合要求，并且确认两批药材进行了苏丹红IV染色。由于目前龙血竭药材的收录标准中未有非法染色的检查项目，且非法染色的苏丹红对人体伤害具有一定的致癌性，很大程度上威胁这患者的用药安全，难以保证药品的有效性，因此为了药材的的使用安全，建议将苏丹红的染色鉴别增加到龙血竭药材标准中。