灵芝孢子粉和灵芝子实体中麦角硫因的含量测定

付 佳 胡燕燕# 周俊甫 潘新华 康 洁* 陈若芸*

（1.中国医学科学院 北京协和医学院药物研究所，北京 100050；2.江西仙客来生物有限公司，江西 九江 332000）

麦角硫因（L-ergothioneine，EGT），化学名为2-巯基-L-组氨酸甲基内盐，是一种天然氨基酸，存在于很多动植物体内，但动物机体自身不能合成，只能从食物中摄取，属于稀有氨基酸[1]。1909年研究人员首次从麦角的菌核中分离得到该种氨基酸并命名，随后在动物血液中也发现其存在，这引起了人们极大的兴趣[2]。

自麦角硫因被发现以来，人们对其性质和生物学功能的研究不断深入。麦角硫因纯品为白色晶体，具有良好的水溶性，室温下可溶解，在强碱条件下稳定。研究发现，麦角硫因具有显著的抗氧化活性，机制主要为：①直接清除活性氧；②螫合各种二价金属阳离子；③激活抗氧化酶，如谷胱甘肽过氧化物酶和锰超氧化物歧化酶，并抑制超级氧化激酶，如NADPH-细胞色素C还原酶；④影响各种血红素蛋白如血红素和肌红蛋白[2]等的氧化作用。此外，麦角硫因作为一种天然的生物活性物质，还具有调节代谢、解毒、维持DNA的生物合成和细胞的正常生长及细胞免疫等多种生物学功能[3]。

李虹奇等[4]1993年首次从赤芝孢子粉中分离得到麦角硫因。进一步研究发现，麦角硫因主要存在于真菌、谷类植物体内，尤以真菌中存在最为普遍，这一发现为灵芝孢子粉的质量控制提供了新的思路和依据。本文采用高效液相色谱（HPLC）法测定不同产地的灵芝孢子粉及子实体中的麦角硫因含量，以期为麦角硫因的应用和灵芝孢子粉的质量控制提供参考。

1 试验材料

1.1 灵芝孢子粉样品

破壁孢子粉B-1 产自广州中山，B-12 产自浙江庆元。未破壁孢子粉B-2、B-3、B-4 产自江西九江，B-7、B-8 产自浙江龙泉，B-9 产自安徽金寨小枝。段木灵芝未破壁孢子粉B-5 产自龙泉。B-6、B-11 为灵芝破壁孢子粉胶囊，产地分别为江苏南京和福建福州。B-10 为破壁孢子粉压片，产地为浙江武义。

1.2 灵芝子实体样品来源

Z-1、Z-2 为北京市售赤芝，Z-3 为福建紫芝，Z-4为长白山鹿角灵芝，Z-5为广东韶关草栽灵芝，Z-6为吉林长白山灵芝，Z-7为西藏林芝野生灵芝，Z-8 为江苏灵芝饮片，Z-9 为西藏林芝白肉灵芝，Z-10 为广东广州赤芝，Z-11 为贵州野生灵芝，Z-12为北京赤芝（超声波粉碎），Z-13 为山东泰安灵芝饮片，Z-14 为吉林段木灵芝，Z-15 为江苏启东灵芝。

2 试验方法

参照文献[5]的试验方法，简便易行。

2.1 标准品溶液的制备

精密称取麦角硫因标准品0.5 mg，加入色谱甲醇2 滴，加水至0.5 mL，所得浓度为1 mg/mL，加水稀释10 倍，得到标准品浓度为0.1 mg/mL。

2.2 供试品溶液的制备

分别称取灵芝孢子粉样品各1 g，加入纯水10 mL，超声1 h，温度60 ℃；分别称取灵芝子实体样品各1 g，加入纯水15 mL，超声1 h，温度60 ℃；取适量上述提取物置于离心管中，以10 000 r/min，离心3 min，取上清液，用微孔水相滤膜过滤即可。

2.3 色谱条件

色谱柱（氨基柱，ZORBAX NH2 250 mm×4.6 mm，5 µm）流动相为乙腈，5 mmoL 醋酸铵水溶液（80∶20），等度洗脱，流速1.0 mL/min，进样量10 μL，柱温25 ℃，检测波长254 nm，得到麦角硫因标准品（A）和灵芝孢子粉（B）的HPLC图谱（图1）。

图1 麦角硫因标准品（A）和灵芝孢子粉（B）的HPLC 图谱

2.4 标准曲线的绘制

按上述色谱条件将标准品进样，进样量分别为1、2、4、8、16 μL，测定峰面积，以进样量（μg）为横坐标，以标准品峰面积为纵坐标，绘制标准溶液曲线。

由图2可知，麦角硫因标准品在进样量为1～1.6 μg（浓度为0.1 mg/mL）范围内，与峰面积呈现出良好的线性关系，线性回归方程为：Y=328.1X-16.20，R2=0.999。

图2 麦角硫因标准品的标准曲线

2.5 仪器精密度测定

按上述色谱条件将标准品重复进样6 次，每次进样量为4 μg，测定色谱峰面积，计算RSD 值。结果显示RSD=0.51%，表示在该色谱条件下仪器精密度良好。

2.6 麦角硫因的含量计算

各样品按2.2 节方法制备供试品溶液，按2.3节方法测定各供试品峰面积，代入标准曲线，计算供试品中麦角硫因的含量（10 μg/μL），利用计算公式计算各样品中麦角硫因的总含量，每个样品平行试验3 次，公式：

式中，C为供试样品中麦角硫因的浓度（mg/mL）；V=10 mL；M为各样品的质量（mg）。

3 样品测定结果

3.1 灵芝孢子粉中麦角硫因的含量测定结果

测定结果表明，灵芝孢子粉中均含有麦角硫因（表1），其中有9 个样品的麦角硫因的含量在0.2‰～0.5‰之间，另外3 个样品的含量在0.04‰～0.08‰。

表1 不同产地不同批次灵芝孢子粉中的麦角硫因含量

3.2 灵芝子实体中麦角硫因的含量测定结果

采用相同的方法对15 个不同产地和批次的灵芝子实体中的麦角硫因含量进行测定，结果显示这15 个灵芝子实体样品中均不含麦角硫因。

4 小结与讨论

本试验首次采用高效液相色谱法测定不同产地和批次的12 个灵芝孢子粉样品及15 个灵芝子实体样品中麦角硫因的含量，结果显示：灵芝孢子粉中麦角硫因的含量有9 个样品在0.2‰～0.5‰之间，另外3 个样品在0.04‰～0.08‰之间。所测灵芝子实体均不含有麦角硫因。高效液相色谱法测定灵芝中麦角硫因的含量，具有高效快捷、操作简便、结果准确等优点，可有效地测定灵芝中麦角硫因的含量。试验结果为灵芝中麦角硫因的含量测定提供了科学依据。

麦角硫因是一种稀有的天然氨基酸，具有多种药理活性，其中以抗氧化活性最为显著，并且不具有毒副作用，是一种公认的较为安全的天然活性物质，在医药、保健、食品等行业具有广泛应用前景[1]。在检测中发现灵芝孢子粉样品B10、B11、B12 麦角硫因含量比其他样品低了一个数量级，原因是这些样品曾经进行过水洗，表明麦角硫因水溶性较强，水洗导致流失较多，也提示要注意灵芝孢子粉的水洗问题。

研究发现，麦角硫因可以由许多微生物如真菌和放线菌自身合成，尤以真菌中存在最为普遍。我国真菌资源丰富，目前国内对麦角硫因的研究主要集中在树舌、桦褐孔菌、平菇和金针菇等上[3,5]，本研究为灵芝中麦角硫因的开发利用提供了新的方向。