肝癌相关锌指蛋白/转录因子异常机制及其临床价值

赛文莉，姚 敏，姚登福

1.南通大学附属医院临床医学研究中心（南通226001）；2.南通大学医学院免疫学系（南通 226001）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我国最常见的恶性肿瘤之一。HCC 发生的主要病原学因素与慢性持续性乙肝病毒（HBV）、丙肝病毒（HCV）感染，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）及毒物摄入等密切相关[1-3]，为多基因参与、多阶段进展的肝细胞恶性转化。其机制复杂，早期诊断难，治疗效果不理想，预后差[4-5]。临床与基础的最新研究显示，锌指蛋白家族（zinc finger proteins，ZNFs）是人类基因组中最大的转录因子家族，是参与调控细胞分化、胚胎发育和多种疾病相关的功能性蛋白质[6]。复杂的ZNFs及其多达18种的Krüppel-like转录因子（KLFs）异常与多种肿瘤进展[7]。作为转录激活因子调控细胞周期和增殖分化，在肝细胞恶性转化或HCC 进展中，已发现有多种ZNFs 和至少7 种KLFs参与HCC 细胞增殖、分化、侵袭和转移过程[8]。本文综评了HCC 进展密切相关ZNFs 和KLFs 研究的新进展。

1 ZNFs/KLFs结构与功能

由2%人类基因编码ZNFs具丰富生物多样性功能，参与调控细胞分化、胚胎发育，参与多种肿瘤进展[8]。除与DNA 结合外，也与RNA、蛋白质和脂质相互作用的能力[9]。依据锌指半胱氨酸（Cys）和组氨酸（His）残基所围绕Zn2＋空间构型，可将ZNFs 分为C2H2样（C2H2like）、塞结状（Gag knuckle）、高音谱号（treble clef）、带 状（Zinc ribbon）、Zn2/Cys6型（Zn2/Cys6）、TAZ2样（TAZ2domain like）、短Zn2＋结合环（short Zinc binding loops）和金属硫蛋白（metallothio⁃nein）等8 种[6]。广泛研究的是C2H2型，其蛋白羧基端以线性重复排列，除串联锌指结构外含Krüppel相关保守盒（Krüppel-associated box）、痘病毒锌指（poxvi⁃rus zinc finger）等功能域[7]。KLFs含17个成员（KLF1～17）由73个氨基酸组成，羧基端含3个保守C2H2结构域，锌指含23～25个氨基酸，不同成员间高度保守，可激活/抑制靶基因转录，优先与“GC box”或“CACCC”位点结合，含与靶DNA结合锌指结构域[10-11]。

ZNFs含通过结合Zn2+稳定的短的可自我折叠形成“手指”结构的蛋白质，具有重复结构的氨基酸模板，相隔特定距离的胱氨酸结合锌指，因其自身结构特点可选择性结合特异的靶结构[12-13]，与靶分子DNA、RNA、DNA-RNA 序列特异性结合，在转录和翻译水平上调控靶向基因表达，在基因表达调控、细胞分化、胚胎发育等过程中发挥重要作用[14-15]。KLFs通过多种调控机制对靶基因进行激活或抑制，控制靶基因表达，功能异同，可分为：①与羧基末端结合蛋白（Ctbp）相互作用的转录抑制因子KLF3、KLF8和KLF12；②结合去乙酰酶的转录激活因子KLF1～2、KLF4～7；③与共同转录辅助抑制因子sin3A 相互作用而产生抑制因子KLF9～11、KLF13～14和KLF16[6，16-17]。KLFs 可调节生长、发育、分化、增殖和胚胎发育等，通过多种调控机制激活或抑制靶基因表达，具有相对组织特异性，诱导多能干细胞，参与机体免疫调节和新血管生成，或与不同启动子结合后异常转录，从而影响肿瘤的生物行为[18-19]。

2 肿瘤相关ZNFs/KLFs表达与调控机制

ZNFs/KLFs分布于人体多种组织，在前列腺癌、甲状腺癌、食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、肠癌、膀胱癌、乳腺癌和宫颈癌等多种肿瘤中异常表达，发挥促癌或抑癌作用[20-25]。睾丸组织表达的ZNF165 为组织特异性抗原（CT-Ag），但三阴性乳腺癌（TNBC）中见CT-Ag表达，与SMAD3结合调控转化生长因子-β依赖基因转录，促进TNBC 细胞增殖和肿瘤生长[26]。原发性结肠癌中ZNF281表达在肿瘤进展过程中增加，并与复发相关，ZNF281 是EMT 调控网络的一个组成部分，它有助于结直肠癌的转移形成[27]。膀胱癌中ZNF165 mRNA和蛋白均过表达，可作为一种新的诊断生物标志物或用于发展膀胱肿瘤特异性免疫治疗的靶点。KLF6在前列腺癌、神经胶质细胞瘤、结直肠癌、肝癌等中是一种肿瘤抑制因子，不同剪接变异体可在不同肿瘤起源、发展过程中发挥作用[28-29]。

ZNFs 结构复杂，功能巨大，调控机制形式多样[12，30]，如C2H2型ZNF 在HCC 进展中调控可归类①转录水平调控：ZNFs 基因启动子CpG 岛区域被甲基化，从而抑制ZNFs 基因转录；②转录后水平调控：ZNFs 蛋白在肿瘤组织中的表达差异由癌症相关的miRNA 调控；③翻译后水平调控：不同的环境刺激会激活信号转导级联反应，使ZNFs 发生翻译后修饰，如乙酰化、磷酸化等，PTMs 调控影响ZNFs蛋白与其他蛋白和靶基因DNA结合的能力；④与序列特异性DNA结合水平调控：ZNFs以不同结构域或蛋白翻译后修饰（protein post-translational modifica⁃tions，PTMs）结合方式招募相互作用蛋白[31]，包括转录辅助激活因子/辅助抑制因子、染色质修饰因子和其他转录因子，最终与序列特异性DNA结合激活或抑制下游基因调控细胞的增殖、凋亡、侵袭与转移，且不同调控层次致ZNFs 在肿瘤发生中的作用机制异同[32]。

3 ZNFs/KLFs对HCC的促进作用

ZNFs/KLFs 表达在HCC 进展过程中发挥调控作用，包括转录辅助激活因子/辅助抑制因子、染色质修饰因子和其他转录因子，最终与序列特异性DNA 结合激活下游基因调控癌细胞增殖、抑制凋亡、促进侵袭或转移等，肝癌相关ZNFs/KLFs的促进作用归纳详见表1。

表1 几种肝癌相关ZNFs/KLFs的促癌作用[33-48]

3.1 促进肝癌细胞增殖

由12个锌指结构域组成的ZNF233在HCC组织中显著过表达，与患者的肿瘤分期及预后相关，细胞研究证实敲除ZNF233基因可抑制癌细胞增殖[30]；定位于1号染色体的ZNF281（ZBP99）由Snail 和miR-34a/b/c共同调控，参与胚胎干细胞分化与组织发育，其表达促HCC 增殖与转移有关；沉默ZNF281显著下调炎症介质（IL-8，IL-1 β，IL-17，IL-23）和上皮间质转化（EMT）信号、TIMP-1、纤维连接蛋白和α-SMA 表达，EMT 诱导因子Snail 直接诱导ZNF281转录，抑制miR-34a/b/c，缓解ZNF281mRNA被miR-34 下调[34]。HCC 组织ZNF384 表达，上调Cy⁃clin D1促HCC细胞增殖，且与肿瘤复发和总体生存率差明显相关[35]。ZNF191 与Wnt8B 启动子nt1491（ATTAATT）和nt1178（ATTC ATT）结合，经Wnt 通路促进HCC增殖；HCC组织中ZNF143过表达，通过与序列特异性DNA结合，具转录因子活性在体内外促进癌细胞增殖、集落形成和肿瘤生长[36-37]。肝癌ZNF267、ZNF217 和ZNF667 过表达，通过调节Bcl-2和Bax表达促进细胞增殖、侵袭和迁移[38-40]；KLF5过表达上调CD44 使HCC 细胞耐药，小干扰RNA 敲除KLF5，影响HCC细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学行为[41]。

3.2 阻断促凋亡信号

ZNF32 定位于10q23-q24 染色体区域，在HCC显著上调，在活性氧（ROS）下SP1 靶向激活ZNF32转录、靶基因补体1q结合蛋白（C1QBP）活化逃避氧化应激诱导的凋亡；ZNF689 具有致瘤性，与转录辅助阻遏物TIF1β相互作用，通过抑制Bak/Bax/Bid 通路阻断促凋亡信号，其表达与瘤体大小、包膜浸润及微血管浸润显著相关；ZNF689过表达者总生存时间短、预后差[42-43]。

3.3 促新血管生成与复发

HCC 组 织ZNF687 为C2H2型，其上调活化NF-kB 靶基因参与调节新血管生成[44]。KLF8 为促癌基因，肝癌KLF8 表达与MMP-9 正相关，MMP-9 是KLF8 下游靶基因，KLF8 表达致MMP-9 增加，促进癌细胞的浸润及转移，KLF8 通过PI3K/AKT 通路诱导VEGF 表达，可活化Wnt/β-catenin 通路参与肝癌浸润和转移，Wnt3a可刺激KLF8表达；另KLF8表达提高β-catenin 对T-cell factor 4 的招募能力，诱导下游靶基因c-Myc、cyclin D1 及Axin1 活化，促进HCC转移与复发[45-46]。

3.4 其它作用

胚胎干细胞（ESC）和造血干细胞中ZFX 高表达，在51.8%肝癌过表达，体外细胞水平上，沉默ZFX 基因转录使癌细胞发生G0/G1 期阻滞，而抑制HCC细胞的自我更新、集落形成和细胞增殖能力，使HCC对顺铂药物敏感性增加；ZFX与Nanog和Sox-2启动子结合后在HCC细胞中过表达，体内移植模型显示ZFX过表达促进HCC生长，显示肝癌细胞具有干性和多功能性[47]。HCC中表达的ZNF165核苷酸序列与睾丸中ZNF165相同，以重组ZNF165，测定HCC患者ZNF165，仅5%患者血清检到ZNF165 抗体，表明ZNF165 为新的CT 抗原，引起体液免疫反应参与肿瘤生物学[48]。

4 ZNFs/KLFs对HCC的抑制作用

同样，庞大的ZNFs/KLFs 表达在HCC 进展过程中，发挥转录抑制、激活下游抑癌基因、诱导细胞凋亡、激活P53、抑制相关通路关键信号分子阻止癌细胞EMT 转化，对HCC 侵袭或转移等具有抑制作用，临床及基础研究发现的主要相关ZNFs/KLFs，见表2。

表2 几种肝癌相关ZNFs/KLFs的抑癌作用[49-60]

4.1 诱导肝癌细胞凋亡

ZNF307（ZKSCAN4、ZSCAN36 和ZNF427）显著下调，作为一种肿瘤抑制剂通过诱导细胞凋亡抑制癌细胞增殖。HCC 组织和细胞中ZNF307 过表达，调控凋亡关键因子如caspase-3、BAX 和BCL-2，促进细胞凋亡[49]。ZBP89（ZNF148、BFCOL1和BERF-1）与Bak 启动子靶向结合促进其转录，抑制干性细胞更新，诱导癌细胞凋亡[50]。KLF9为抑癌基因，在肝癌组织表达下调。KLF9直接结合p53启动子近端区域内GC盒稳定p53，其药理学或遗传活化对HCC可能具有治疗作用，对SK-Hep1和HepG2细胞生长有明显抑制作用，并致细胞凋亡[51]。位于19q13.13号染色体上ZNF545过表达，可抑制肝癌Snur449和Huh7细胞增殖、迁移和侵袭，诱导细胞G1/S期阻滞和凋亡，体内、外研究证实其机制为抑制NF-KB 活化、细胞增殖和移植瘤生长[52]。

4.2 抑制相关通路信号分子

ZNF774是一个转录抑制因子，亲和纯化偶联质谱法显示ZNF774与胞中Mi-2/核小体重构和去乙酰化酶复合物（NuRD）有关联，全基因组鉴定ZNF774/NuRD 复合体表明，ZNF774 抑制含notch2 肝癌生长和迁移密切相关基因，体外抑制癌细胞增殖和侵袭，体内抑制癌细胞生长和转移。ZNF774明显下调与高notch2 表达、晚期病理分期及患者总体生存率低密切相关，提示ZNF774/NuRD-notch 2 轴在肝癌发生中的关键作用[53]。KLF10 或称转化生长因子-β诱导早期基因1（TIEG1），为含三C2H2 锌指结构域的DNA 结合转录调节因子，与DNA 上特异性蛋白1（SP1）位点结合并与其他调控转录因子相互作用促进/抑制基因表达，具有抗增殖作用，诱导多种癌细胞凋亡[54]。

4.3 抑制HCC侵袭转移

抑制肿瘤转移和上皮间质转化（EMT）有关。位于19q13.13 号染色体ZNF382，在HBV 阴性肝组织和HBV 感染肝硬化组织中表达显著增高，是mir-6867靶标，作为一种潜在癌细胞抑制因子，可激活蛋白1（AP-1）和Wnt/β-catenin 通路活化，激活p53表达，诱导凋亡，抑制原癌基因FOS和JUN等下游靶点发挥作用，抑制裸鼠癌细胞增殖、集落形成、迁移、侵袭和致瘤潜能，抑癌基因ZNF382在HBV相关HCC 中受表观遗传机制调节[55]。CD9 和CD81 是KLF4 转录靶点，调控KLF4-CD9/CD81-jnk 信号通路，有望抑制HCC发展[56]。转化生长因子β-1（TGF-β 1）/Smad 信号通路在肿瘤抑制中起重要作用，KLF17调控Smad3依赖途径增强TGF-β1/smad信号转导，是抗肿瘤转移和抑制肿瘤生长关键环节。沉默KLF17 可降低Smad 结合元件上Smad3-DNA 形成，影响TGF-β1/Smad靶基因表达，调控该通路经EMT抑制HCC侵袭转移[57]。

4.4 其它作用

由4 个外显子构成的KLF6 位于10p15，含有3个剪接变异体（SV1、SV2、SV3）。KLF6为癌胚抗原具有转录激活功能，不同剪接变异体在肿瘤中发挥不同作用；肝癌中KLF6 SV1为促癌基因，KLF6 SV2是抑癌因子，分别发挥促癌细胞增殖和抗细胞增殖或凋亡作用[58-59]。脂肪生成被认为是肝癌发生发展关键，ZHX2 为新生脂肪形成的重要抑制因子，异位表达显著抑制HCC 新脂肪生成，降低FASN、ACL、ACC1 和SCD1 转录，与脂肪调控因子SREBP1c 呈负相关。沉默或过表达ZHX2，转录水平上增加mir-24-3p 作用于SREBP1c 靶点致其降解，提示ZHX2 抑制肝癌进展新机制，可为HCC 治疗提供新策略[60]。

5 ZNFs/KLFs分析的临床价值

肝癌相关ZNFs/KLFs 基因转录异常，在肝癌组织或循环血中的表达水平改变，有助于良恶性肝病诊断、HCC预后判别或分子靶向治疗。

5.1 良、恶性肝病鉴别

肝癌ZNF191 过表达直接转录调控，在HCC 增殖中发挥关键作用[36]；KLF4 为诱导HCC分化介质，可提高HCC 预测准确性[61]；KLF5 转录因子在良、恶肝病中的表达存在显著差异，有助于良、恶性肝病的诊断与鉴别诊断，初步临床应用（待发表资料），显示可特异诊断HCC，优于常规AFP分析。

5.2 预后标志物

肝癌患者组织或血ZNF281、ZNF384、KLF5 等表达升高，与瘤体大小、肿瘤分期、肿瘤复发及血管侵袭性等呈正相关，与患者的总体生存率差相关；HCC 组织KLF4 和Sp1 表达与肿瘤分化显著相关；KLF6 与HCC 患者淋巴血管空间侵袭呈负相关，KLF6 阴性患者生存时间短。KLF17 是抑癌基因，能与突变型p53 形成复合物抑制HCC 患者的EMT 形成。HCC 中ZFHX3 上调，是HIF-1a/VEGFA 的血管生成因子所必需，可见ZNF281、ZNF384、KLF5 等表达升高，与瘤体大小、肿瘤分期、肿瘤复发及血管侵袭性等相关，与患者总体生存率相关，可作为HCC预后标志物[34-35，41，58]。

5.3 分子靶标

ZNF267参与调控发育、增殖和分化等生物学过程，在肝硬化及癌组织均升高，靶向ZNF267 可抑制HCC 增殖和迁移[38]。ZNF191 与Wnt8b mRNA 启动子ATTAATT（nt-1491）和ATTCATT（nt-1178）结合，直接调控转录，在HCC 进展中发挥关键作用[36]。KLF6过表达抑制了异种移植肿瘤的生长，在体外和体内抑制HCC生长和侵袭，具抑癌功能可能用于预防和治疗[58]。KLF5激活PI3K/AKT/Snail通路诱导EMT发生，是调控HCC中CSCs关键转录因子[41]。KLF8激活wnt/β-连环蛋白促干细胞样，靶向KLF8可抑制HCC[45]。另ZHX2 表达增加miR-24-3p，可靶向SREBP1c 抑制HCC进展[60]。位于20q13的ZNF217基因与miR101结合，可促进癌细胞增殖与侵袭，以及ZNF23等调控HCC增殖和分化，均可望成为HCC治疗靶点[30，39，62]。

6 展望

ZNFs/KLFs作为人类基因组中最大的转录因子家族，广泛参与了人体多种生物学过程，在肝细胞恶性转化中调节下游基因转录，参与细胞增殖、凋亡、侵袭与转移，发挥促癌/抑癌作用。现有资料显示ZNFs/KLFs的转录表达，与HCC关系密切，已引起医学界的高度重视，但因该家族相关分子种类繁多、结构复杂，随着对该家族相关因子研究的深入，解析HCC 发病机制和论证有价值的关键ZNFs/KLFs 分子，将有助于HCC 早期诊断和预后判断，以及特异分子靶向干预技术开发与临床应用。