分子标记在连翘种质资源研究中的应用

昌秦湘，王晓芳，闫 钊，杨忠义，纪 薇

（1.太原学院园林科学研究所，山西太原 030012；2.太原学院艺术设计系，山西太原 030012；3.山西农业大学园艺学院，山西太谷 030801）

连翘（Forsythia suspensa）为木犀科连翘属的落叶灌木，花金黄色、先叶开放，花期为3—4 月，单花期可持续20 d 以上且耐修剪[1-2]；连翘果壳为重要的中药材，分为“青翘”和“老翘”2 种[3]，果实、根皮也可入药。我国野生连翘资源分布广泛，除华南地区外，其他地区均有种植[4]，尤其以延安、汉中、洛阳、临汾、五台、陇南、天水等秦岭山脉中东部山区自然分布最广。连翘作为一种兼备观赏与药用价值的树种，目前在种植栽培技术[5]、分子生物代谢成分分析[6-7]等方面已开展研究。连翘作为山西重要道地药材与“十大药茶”之一，推进药材标准化、规模化势在必行。随着连翘新品种的涌现与育种目标的提高，筛选优质高产的连翘种质资源意义重大，对研发连翘特异性分子标记技术提出更高的要求。

目前，分子标记在连翘种质资源及遗传育种方面应用最广的是随机扩增多态性DNA（RAPD）、简单序列重复（SSR）与简单序列重复区间扩增多态（ISSR）。RAPD 是以PCR 技术为基础、检测DNA 多态性的第一代分子标记[8]；SSR、ISSR 是以PCR 为核心的第二代分子标记[9]，相比于RAPD 具有多态性丰富、稳定性高、操作简单和重复性好等特点[10-11]。单核苷酸多态性（SNP）被认为是当前最具应用前景的分子标记，作为第三代分子标记比第一、二代分子标记工作效率更高，适用于大样本检测[12]。SNP 主要指单个核苷酸变异导致在基因组水平上的DNA序列多态性[13]，具有遗传稳定性高、位点丰富、自动化分析、二态性及等位基因性等[14]特点。目前四类分子标记已在文冠果[15]、金银花[16]、苹果[17]、羽衣甘蓝[18]、皱皮木瓜[19]、梨[20]等物种的品种鉴定、遗传图谱构建、亲缘关系等方面有广泛研究。因此，笔者将从以下几个方面综述分子标记在连翘种质资源与遗传育种中的应用，以期为连翘遗传育种研究提供参考。

1 品种鉴定应用

连翘因早春花朵繁密、抗逆性强、药用价值高等特点，种植范围扩大及新型品种的增多，导致同物异名或异物同名现象普遍，为连翘育种与生产带来阻力。分子标记技术的研发有效提高连翘品种鉴定效率，目前RAPD、SSR、ISSR 技术得到了广泛的应用。SHIM等[21]利用RAPD 技术对连翘金叶新品种进行DNA 指纹图库分析。

SUH 等[22]运用RAPD 技术对荷兰、美国、韩国三地连翘杂交品种鉴定，发现由RAPD 标记生成的树状图中，分为2 个簇，其中，CL-I 簇多数为F.×intermedia 杂交品种（Forsythia suspensa 和Forsythia koreana），CL-II 簇包含Forsythia europaea、Forsythia densiflora、Forsythia mandshurica、Forsythia japonica、Forsythia viridissima、Forsythia ovata 及其衍生物等。顾华等[23]用40 种RAPD 引物对山西5 个地区的11 个连翘品种区分开来。张璐[24]用RAPD 技术设计的30 对引物完成了对7 个连翘品种道地性的分类。何苗[25]运用SSR 技术对贯叶连翘进行位点分析，获得了7 643 个位点，并设计了贯叶连翘特异性SSR 引物。FU 等[26]使用9 个微卫星（SSR）位点分析20 个连翘种群的差异，扩增出134 个等位基因来区分186 个品种。KIM等[27]选用93 个ISSR 扩增带对5 个种群的连翘品种进行鉴定分类。李璐等[28]采用ISSR 分子标记对连翘25 个自然种群鉴定，用筛选的13 条引物共扩增出353 条清晰条带，通过清晰条带上的基因型区分195 个品种，为研究连翘种质资源与遗传多样性提供了参考。

2 遗传多样性和亲缘关系的应用

遗传多样性反映种内性状的差异及对环境适应、改造的潜力[9，29]。分子标记在连翘遗传多样性的应用，加快了其育种的效率与品种的改良。

2.1 遗传多样性研究

李汉伟等[30]运用RAPD 研究不同花柱类型连翘遗传多样性，为不同产地、花柱类型的连翘构建了指纹数据库。FU 等[31]开发了第一套连翘微卫星标记来评估遗传多样性，从100 个SSR 基因座筛选出70 对引物，其中，11 个位点显示出基因多态性。同时，在连翘种群遗传多样性参数中基因座的等位基因平均值为4.2，近交系数为0.212～0.500，发现种群中基因型不平衡，存在显著的等位基因关联。孟令芝[32]从设计的76 对SSR 引物中筛选出11 对具有多态性的引物进行连翘多样性检测，结果表明，不同地区连翘遗传变异与产地、生长因子相关联。WANG 等[33]从连翘已检测到的3 199 个SSR 引物位点中，选取40 个位点研究16 个地区连翘的遗传多样性，结果发现，32 对清晰引物扩增带，其中12对具有多样性。汤正辉等[34]应用ISSR 分析河南连翘6 个自然种群的遗传多样性，结果显示不同地区连翘的遗传多样性很高。KIM 等[27]采用ISSR 研究Forsythia ovata Nakai 的遗传多样性，平均每个ISSR 引物扩增数为6.6 个，该连翘品种的多样性相对于其他灌木物种低。姜涛等[35]利用SLAF-seq 技术获得1 809 741 个SNP 分子标记，对39 份连翘种质资源进行遗传多样性分析。LI 等[36]对中国15 个自然种群的连翘进行SNP 鉴定，获得了1 120 232 个SLAF 基因座，每个SLAF 基因座的平均测序深度为11.51×，在这些SLAF 基因座中有1 021 768 个是多态的，其中的575 792 个高质量SNP 用于后续的群体遗传多样性分析。

2.2 亲缘关系分析

顾华等[23]运用40 个RAPD 引物研究山西6 个地区11 种连翘品系的亲缘关系，结果表明，不同区域的品系可划分为2 个基因型，在DNA 水平上差异多样化。吴婷[37]基于RAPD 扩增带与UPGMA 法，对14 种连翘药材进行亲缘关系分析，按照不同遗传相似系数划分，得到山西地区连翘亲缘关系较近且能区分于其他省份的连翘品种。夏伟[38]采用SSR研究4 种果型、不同产地连翘的亲缘关系，果型分析表明，FC、TY、JFC 较LY 果型的亲缘关系更近，LY 遗传稳定性好，可将其推选为新型品种；地域分析表明，12 个连翘种群的基因交流比较密切，来源与地理距离无关。同时，还利用ISSR 分析了山西、河南省25 个连翘居群的遗传变异性与遗传距离，得出66.82%的变异性存在于居群内，遗传分化明显，遗传距离与海拔、地形、压力等环境、生态因子有关。王琳[39]通过ISSR 扩增引物分析不同省份连翘的亲缘性，结果表明，4 个省份连翘的遗传相似度在0.982 7～0.990 3，遗传距离范围为0.009 7～0.017 5，说明了遗传相似度很高，尤其是山西与河南之间；遗传距离的远近与地理位置有一定的关联，其中，山西与河北的遗传距离最远。

3 DNA 指纹图谱的构建与关联分析的应用

利用分子标记构建连翘的基因指纹图谱，可选择较少的引物，快速高效的鉴别更多的资源。冯帅[40]提取连翘中的DNA 得到ITS2 序列，以此作为DNA条形码序列来辨别连翘的真伪。又基于PCR-RAPD分子标记，建立不同产地连翘的生物指纹图谱，以便对连翘与金钟花进行鉴别。吴婷等[41]通过45 条RAPD 引物对14 批不同产地的连翘进行筛选，结果获得11 条多态性指纹位点数据，建立了DNA 指纹图库，以便对不同产地的连翘进行鉴别。

连翘自然群体进化中受选择、突变、重组等影响，导致部分等位基因存在非随机的关联，可基于分子标记技术分析连翘生长调节、基因特异性表达等关联应用。付子真[42]结合微卫星位点分析连翘遗传结构，结果发现，连翘的遗传多样性低于其他种子植物，其中花粉传播的基因流是影响连翘种群分化的关键因素，为连翘资源的利用与保护提供了依据。SUN 等[43]采用SNP 研究连翘中ENR（恩诺沙星）与耐ENR 菌株基因的差异表达，结果显示，82个具有突变基因的SNPs 表达上调，31 个SNPs 表达下调。WANG 等[44]从连翘中获取完整的叶绿体基因组，对检测到的54 个SSR 分析叶绿体基因序列，发现叶绿体SSRs 大部分由单核苷酸和二核苷酸重复组成，分别被标记35 次和7 次；SSR 可能是特定于谱系标记，多数SSR 位于IGS 和内含子中，仅有5 个位于编码区中，为后续研究连翘进化和遗传多样性提供了依据。

4 展望

近年来，4 类分子标记在连翘品种鉴别、遗传多样性、DNA 指纹图库的构建等方面开展了许多的研究，开发出一些与目标性状相关的特异性分子标记，为连翘种质资源的保护与利用提供了理论依据。但分子标记在连翘方面的应用比较局限，如ISSR、SNP 技术的开发与应用处于起步阶段，在连锁图谱构建、抗逆性QTL 定位及药材质量评价、开花、种子性状关联分析等方面的应用较为缺乏。这也后续为连翘分子标记的应用提供广大的研究空间，可基于新一代分子标记技术建立优质连翘品种资源库、提高标记选择的准确性和高效性，完善连翘优良性状关联分析与辅助育种等的应用。