桑黄裂蹄针层孔菌的发酵培养、化学成分及生物活性研究进展*

马传贵，张志秀，孙思胜，钟耀强

（1.北京京诚生物科技有限公司，北京 大兴 102600；2.许昌学院食品与药学院河南省食品安全生物标识快检技术重点实验室，河南 许昌 461000；3.马来西亚国立卫生院药物研究所传统药物研究中心，马来西亚 莎阿南 40170）

1 桑黄裂蹄针层孔菌简介

裂蹄针层孔菌（Phellinus linteus，PL），寄生于桑科白懂桑树干上，是最常使用的一种桑黄，主要分布于中国、日本、蒙古、韩国等亚洲国家以及美洲和非洲，还可以寄生于杨树、柳树、桦木等植物上[1]。作为一种优良、珍贵的药用真菌，被广泛应用于保健品中。

桑黄在中国、日本、韩国等国家使用历史悠久。早在2 000年前的中国汉代，桑黄就记录成为“桑耳”（桑树的耳朵），《神农本草经》中记录了其药用价值[2]。在日本上个世纪初期，“meshimakobu”最早被记录为Fomes yucatanensis或Fomes rimosus的标本[3]，直到1943年，该物种才被命名为尤地针层孔菌（Phellinus yucatanensis） 或者裂蹄针层孔菌（Phellinus linteus）[4]。桑黄还被记录用于止血和一些与女性月经有关疾病的治疗[5]。除此之外，《本草纲目》[6]《中医字典》[7]等都记载了桑黄是一种利尿止血、改善内脏的食用菌。2020年7月13日，国家卫健委、国家中医药管理局首次将桑黄列入“中药”行列，已通过权威专家及国家认可，正式获得中药身份。根据长期的应用和实践经验，桑黄具有调节血糖、改善血液循环、保肝、增强免疫功能等多种药理活性，并被试验证明具有抗肿瘤、免疫调节、抗炎、抗氧化以及抗高血脂症和抗糖尿病等活性作用[8-9]。

2 桑黄裂蹄针层孔菌的发酵培养

桑黄裂蹄针层孔菌是一种优良的药用菌，具有多种生物活性，在东亚地区得到广泛应用。对于桑黄产品的生产类型，主要有野生子实体、栽培子实体、液态发酵、固态发酵4种[10-12]。依据中经视野咨询公司对我国桑黄行业市场的预测分析报告发现，我国1995年～2002年野生桑树桑黄年产量为2 t～3 t，当时还有大量日本、韩国商人来华购买；在2003年～2012年产量处于1 t～2 t的低潮期；直到2013年由于新种发表产量才逐渐提升。预估今后新产地的发掘和开发、人工栽培的实现也会使其产量增长。

由于桑黄野生资源稀缺，人工栽培不成熟，通过发酵生产，既可以缩短培养周期，避免季节和环境的限制，又可以提升桑黄作为新药开发的效率。当前大量研究集中在对发酵条件的优化，其中Lee等[13]通过固体培养试验发现，在乳糖浓度为29.7 g·L-1、温度26.2℃、pH 5.2的条件下，菌丝的最快生长速率为2.80 mm·d-1。丁兴红等[14]以桑黄多糖产量为参考指标，筛选适宜的发酵条件，得出其发酵最佳碳源和氮源分别为葡萄糖和大豆蛋白胨，最佳接种量为6%，初始pH为6.0，适宜温度28℃，转速180 r·min-1。此外还发现在发酵瓶中加入数粒玻璃珠，可以促进菌丝的分散、分裂和增殖。

除上述物理因素外，植物激素和化学成分有利于菌丝的生长和多糖的生物合成。Lee等[15]通过对培养基的优化，提出了桑黄发酵的最佳配方为果糖40 g·L-1、酵母抽提物 20 g·L-1、FeCl2·6H2O 0.01 g·L-1、K2HPO40.46 g·L-1、KH2PO41.00 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.50 g·L-1、MnCl2·4H2O 0.036 g·L-1、ZnCl20.03 g·L-1和CuSO4·5H2O 0.005 g·L-1。而Wang等[16]的优化配方为葡萄糖 51.67 g·L-1、蛋白胨 6.96 g·L-1、酵母提取物 1.0 g·L-1、硫酸胺 5 mg·L-1、K2HPO41.0 g·L-1和MgSO40.5 g·L-1。此外，有研究发现添加适量的萘乙酸、吲哚-3-乙酸、NaCl会影响桑黄形态和多糖的积累和生成[17]。虽然这些研究对桑黄的培养条件进行了优化，但在实际栽培生产中，必须选择合适的培养条件以满足大规模生产桑黄的需求。

3 化学成分

3.1 多糖

在桑黄裂蹄针层孔菌子实体中，多糖是其主要成分，以杂多糖为主，其中甘露糖、半乳糖、果糖、木糖是子实体中的主要多糖，这些多糖大多为水溶性[18]。Kim等[19]用DEAE纤维素阴离子色谱法从桑黄中分离出一种酸性蛋白多糖，经Sepharose CL-4B凝胶过滤后得到其分子量，进一步分析发现蛋白多糖由72.2%多糖和22.3%蛋白质组成，多糖部分主要包括甘露糖、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖和木糖，蛋白质部分含有大量的谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸。另有研究发现与子实体相比，桑黄菌丝体中蛋白质、饱和脂肪酸、多糖、还原糖、总糖和氨基酸含量较高[20]。桑黄菌丝体和发酵液中的主要化学成分也是多糖，但与子实体中的多糖不同。Hwang等[21]从桑黄kctc6190深层培养液中分离出3种胞外多糖，主要由半乳糖和葡萄糖组成。

3.2 黄酮、吡喃酮和呋喃

当前，从桑黄裂蹄针层孔菌中共分离出35种黄酮类、吡喃酮类和呋喃类化合物。其中，4种黄酮类化合物包括黄柏属A类、B类化合物和米昔马考酚A、B（1～4），15种吡喃酮类化合物包括黄绿二聚体A、黄芩苷A～J、黄芩苷C、黄芩素B1和B2（5～19），5种呋喃类化合物包括黄褐属A和B、黄柏黄酮A和B类化合物[22]。莫顺燕等[23]首次从桑黄中分离出柚皮素、樱花苷、芳香苷元、叶绿素、灯盏花苷、灯盏花素等7种黄酮类化合物；并分离出苄基化二氢黄酮类化合物，黄芩素A和黄芩苷B，分别鉴定为5，7，4′-三羟基-6-O-羟基苄基二氢黄酮和5，7，4′-三羟基-8-邻羟基苯二氢黄酮。除此之外，吡喃酮A以及苯丙氨酸A和苯丙氨酸B等新的呋喃成分也被报道出来[24]。

3.3 其他化学成分

部分研究还从桑黄裂蹄针层孔菌中分离获得其他成分。Samchai等[25]研究了桑黄裂蹄针层孔菌的二氯甲烷部分，并根据NMR光谱分析和质谱数据阐明了2种吲哚衍生物，包括7-甲氧基吲哚-3-羧酸甲酯和1-甲基吲哚-3-甲醛。此外，还发现了阿魏酸、丁香酚、原儿茶醛、原儿茶酸、咖啡酸、微量元素、茶碱、环二肽、氨基酸等。

4 生物活性

4.1 抗肿瘤活性

抗肿瘤被认为是桑黄最重要的生物活性，大量的药理试验证实桑黄是一种有效的抗癌药物。1968年，Ikekaw等[26]首次发现桑黄裂蹄针层孔菌子实体提取物对小鼠肉瘤细胞（S180）有明显的抑制作用，抑制率为96.7%。大量研究表明，抗肝癌作用是其最重要的抗肿瘤活性之一。Wang等[27]发现桑黄多糖对人肝癌细胞HepG2有良好的抑制作用，浓度为0～1.0 mg·mL-1的桑黄多糖可显著抑制HepG2细胞增殖，抑制率达50%，且呈剂量和时间依赖性。桑黄多糖不仅能抑制肝癌细胞的生长，而且还能感染黑色素瘤细胞。Zhou等[28]将桑黄（40 g·kg-1d-1、200 g·kg-1d-1、1 000 g·kg-1d-1）提取物分别灌胃C57BL/6小鼠H22（肝细胞癌） 和B16（黑色素瘤）细胞，观察其抗癌作用。最终发现经桑黄处理的H22细胞和B16细胞的细胞因子、IL-12和TNF-α水平均高于未处理组，且CD4+T细胞和CD4+、CD8+水平与剂量呈正相关。半个多世纪以来，中国、日本、韩国等国也开展了一些其他的抗肿瘤研究。根据研究和公开资料，发现桑黄多糖除具有上述活性外，还具有多种抗肿瘤活性，包括肺癌、乳腺癌和前列腺癌[29-31]。

4.2 抗氧化活性

桑黄及其组分表现出较高的抗氧化活性，可用于风湿性关节炎等自身免疫疾病的治疗。Jung等[32]从桑黄菌丝体培养液中分离筛选出具有抗氧化活性的多种化学成分，采用反相高效液相色谱法对成分进行了分析，发现了几个具有强大自由基清除活性的峰，根据光谱分析纯化并鉴定了4种主要活性物质，分别为 hispidin及其二聚体、3，14′-bihispidinyl、hypholomine B 和 1，1-distyrylpyrylethan，且这些物质都以浓度依赖的方式对自由基表现出显著的清除活性。Wang等[33]从桑黄菌丝体中提取了3种部分纯化的多糖（PL-W、PL-A和PL-N），发现其以浓度依赖的方式表现出较强的清除自由基能力和抗氧化活性。除此之外，体外试验也表明多糖具有很强的抗氧化活性，包括对超氧阴离子、羟基和DPPH自由基的还原能力和清除能力[34]。

4.3 免疫调节活性

桑黄裂蹄针层孔菌是一种有效的免疫调节剂。1996年初，Kim等[35]从桑黄菌丝体培养物中纯化出一种多糖，并在体外（100 mg·kg-1）和体内（0.01 mg·mL-1～0.10 mg·mL-1） 观察其免疫调节作用。发现桑黄多糖不仅能刺激混合淋巴细胞反应，从而诱导T淋巴细胞增殖和对同种抗原反应的细胞毒性，而且能调节T细胞依赖性和非T细胞依赖性一级抗体反应，对B细胞起多克隆激活作用，T细胞可提高自然杀伤细胞和巨噬细胞介导的非特异性免疫功能。另外，研究还发现从桑黄中提取的一种新的多糖-蛋白质复合物刺激B细胞增殖比未刺激时高8倍，但T细胞不受影响；且提取物和LPS以相似的方式作用于B细胞，但提取物诱导的细胞活化不受多粘菌素B（LPS的特异性抑制剂） 的抑制[36]。此外，Kozarski等[37]发现32.6 pg·mL-1的桑黄子实体多糖对活化的人外周血单个核细胞（PBMCs）和IFN-γ的合成具有免疫抑制作用。

4.4 降血糖活性

早期研究发现，从桑黄裂蹄针层孔菌菌丝体培养物中纯化的多糖可抑制雌性非糖尿病小鼠自身免疫性糖尿病的发生。8周龄～24周龄雌性非糖尿病小鼠每隔1 d给予30 mg·kg-1多糖进行治疗，可预防自身免疫性糖尿病的发生、发展和免疫细胞向胰岛的浸润，并抑制炎症细胞因子的表达[38]。桑黄多糖也被证明通过阻止β细胞在糖尿病中的活性氧毒性作用而显示出抗糖尿病的功能，其在抑制过氧化氢诱导的细胞凋亡和增加过氧化氢处理细胞的胰岛素分泌方面表现出相似性[39]。除此之外，大量研究发现桑黄降低了血糖和血清胰岛素水平，并抑制了糖尿病患者的α-葡萄糖苷酶活性[40-41]。在血糖调节方面，已有证据表明，具有一定构象的活性多糖可通过提高胰岛素敏感性、丙酮酸激酶（PK）和己糖激酶 （HK） 活性以及磷酸化磷酸肌醇 3激酶（PI3K） 的表达，在一定程度上缓解胰岛素信号传导缺陷[42]。

4.5 其他生物活性

在我国古代中医临床实践中桑黄被广泛应用于治疗血液病。桑黄裂蹄针层孔菌除了具有上述活性外，还发现具有抗病毒，抗诱导突变以及改善肝功能等多种功能。

5 总结与展望

桑黄裂蹄针层孔菌在抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、降血糖和抗炎等方面具有突出的活性功能。因此，有必要进一步发掘和阐明桑黄传统用途与现代药理活性之间的关系，阐明抗肿瘤作用与其他药理作用之间的关系。与此同时，尽管现代桑黄的体内外药理研究作用已经非常深入和丰富，但在临床探索方面的研究还不够充分。除此之外，需要对桑黄裂蹄针层孔菌加工以及其主要成分的提取方法等进行标准化设定，研发相关新药和新食品，提供多样的桑黄产品。