基因芯片技术在中药现代化研究中的应用进展

刘玉峰，许肈初，马海燕

(1.辽宁大学 药学院，辽宁 沈阳 110036；2.辽宁省天然产物制药工程技术研究中心，辽宁 沈阳 110036)

0 引言

中药现代化研究的内容包括：有效成分筛选及新药研发、中药作用机理研究、中药复方研究、中药质量控制及安全性评价、中药基因组学研究和药效变化等诸多方面.由于中药活性成分的复杂性、作用靶点的多样性及产地差异性，造成常规化药评价标准及提取分离和活性筛选不仅效率低、成本高，而且还存在活性成分易丢失，纯度与活性背离的难题[1]，因此快速分析中药微量活性成分，高通量研究全组分作用靶点，区分与治疗无关或毒性组分成为了解决难题的关键.利用高通量生物芯片技术可以在有限的实验条件下获得极为大量的生物信息，使研究工作的效率得到极大的提高，受到科学界的重视.生物芯片包括基因芯片、蛋白芯片、细胞芯片、组织芯片以及其他多种由生物材料制成的芯片[2].由于根据网络药理学理论所有药物都是通过直接或间接修饰或改变人体基因及基因产物产生作用[3]，因此利用基因芯片技术分析药物活性成分影响基因表达多态性变化就成为了解决中药活性成分研究难题的重要思路之一.

基因芯片(Gene chip)又称DNA微阵列，由美国Affymetrix公司的Fodors等[4]在20世纪90年代初提出并研究，是专门用于核酸检测的生物芯片.经过近30年的发展，基因芯片作为高度集成化的分析和研究手段正成为进行药物基因组学研究的主要平台[5-6].基因芯片解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁琐、样品测定周期长、操作测定效率低等不足，其是将大量分子探针附着固定于载体支持物上，可以单次对样品的大量基因序列进行检测分析.根据实际情况具体设计探针系列，选择具有针对性的分析检测方法，可极大地扩展此技术的应用范围，如基因表达谱测定、突变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等[7-10].而要与基因微阵列上的已知序列杂交，就要先通过聚合酶链式反应扩增、体外转录等技术针对样品DNA/RNA掺入标记分子，再通过化学荧光法、同位素法、酶标法或化学发光法检测杂交信号强度，利用计算机软件进行数据比较、综合分析，即可获得样品中大量的基因序列或表达特征信息[11].

尽管中医中药在中国已有几千年的历史，但缺乏高质量的科学证据来证明其有效性[12].因此，西方医学经常以怀疑的眼光看待中医学，这给中医中药走向国际带来了巨大的困难[13].中药成分复杂多样，加上传统的研究手段存在许多局限，这给中药的深入研究带来了很大困难.在分子生物学领域中高通量基因芯片技术作为一种研究分析基因信息的强有力的技术，可成为进行表达中药基因组学研究结果的主要工具[14].当今人们长期以来对中药的认识层次与研究手段的基本保持在低效、低通量，而通过中药基因组学研究开发的中药基因芯片，从分子水平上研究中药的最新技术手段，将从根本上改变这种观念[15].用于基因表达分析的基因芯片可根据其应用分为全局和聚焦DNA微阵列两种类型[16-17]，可用于有效成分筛选[18]、作用机制[19]、中药复方[20]、质量控制及安全性评价[21].全局的DNA微阵列含有数千至数十万个探针，代表部分或全部cDNA，表达序列标签(EST)和各种类型的表达标记，例如用于估计细胞内mRNA拷贝数的芯片.聚焦的DNA微阵列含有几十到数千种针对特定目的设计的探针，例如组织/细胞类型特异性，功能特异性和表达谱分析的研究.当已知作用时，聚焦的DNA微阵列有时更适合于研究作用机制，例如化学品的风险评估和癌症转移风险的预测[22].

近年来，国内外已有一些将基因芯片技术应用到中药研究的报道[23-24].基因芯片技术是中药研究领域中一次具有深远意义的改革，具有极广的发展扩张性与应用深度，为中药现代化的发展提供了新途径.

1 中医传统思维

中医思维可从“道生一，一生二，二生三，三生万物”的角度去理解[25].在中医的视角中万物普遍联系为一个整体，从人体的角度讲，人体每个局部都是一个整体，而不是局部组成了整体，不是局部和局部的联系，是运动中发展联系的变化.而要论贯穿疾病的产生、发展、转归、预后整个全过程的本质即为辩病论治，其为中医本质.

因此治法可分为“同病异治”和“异病同治”[26].这个思想在临床中的体现即为着重对患者的症状特点、体质差异，个性化治疗入手强调辨证施治.基因蛋白调控与修饰整体的变化可以从微观角度反映着生命机体的整体功能状态，疾病在特定证候的本质可以通过基因转录和蛋白整体水平的变化得到反映了.在体内纷繁复杂的序列利用基因芯片技术可以高效准确的找到药物作用靶序列，这在中药现代化研究中极为重要.而面向生物体全遗传组层面上的药物作用分析是基因芯片应用的一个重要领域，由于药物作用于机体疾病的整个过程具有非单一性，从其经过药剂相、药代动力学相及药效相中可知药物在进入体内吸收分布代谢排泄及产生药效的过程大多需要经过不同体内屏障及发生多次结构变化，基因芯片能够通过对上万个基因信息的检测分析，从中获取大量有用的理论依据，从而对中药产生的复杂作用机制提供科学合理的解释，因此利用基因芯片技术对整个药物干预疾病过程中基因表达改变进行监控是具有得天独厚的优势，之后对药效进行评价，为我国传统中医药方剂具有系统调节的治疗作用提供一定的科学依据.

2 中药作用机制研究

从分子水平看，中药有效成分与生物大分子即药物靶点发生相互作用才能发挥药效.而由于中药内化学成分复杂性及多样性等特点，其作用机制复杂多样，治疗疾病时可产生多通路、多靶点、多系统的联合干预作用[27].传统的作用机制研究方法需要对每个样品进行测试，而且操作繁琐，很难达到从整体生物学角度探讨药物的作用机制，这给中药作用机制研究带来了很大的困难[28].

利用基因芯片技术通过比较在有无药物作用的条件下正常与病变组织(细胞)基因表达水平的变化，从而发现疾病相关基因，并以此基因作为中药筛选靶标.基因芯片技术将中药作用机制研究引向全新的深度.郑冬雪、刘津源等[29]在研究基于micRNA表达谱分析加味桂枝茯苓丸干预大鼠子宫肌瘤的分子机制中，利用大鼠miRNA单通道表达谱芯片对保存的大鼠子宫组织中CyDye与RNA进行检测采用NanoDrop ND-1000法，基于R语言，BRB语言对归一化数据进行差异表达基因分析.Real-time PCR验证芯片，结果显示加味桂枝茯苓丸对子宫肌瘤大鼠micRNA基因芯片表达有明显的影响，综合分析芯片生物学信息与模型组相比，中药各组分别有上调、下调的micRNA差异基因，这些micRNA差异基因共同构成了加味桂枝茯苓丸治疗子宫肌瘤大鼠的差异micRNA基因表达谱.各组间miR-187-3p、miR-330-5p表达的变化证实了基因芯片结果的可靠性.靶基因功能富集通路分析得出4条与子宫肌瘤密切相关的信号通路提示加味桂枝茯苓丸对子宫肌瘤的治疗机制涉及多种生物学信息信号传递及基因调控的改变，提示加味桂枝茯苓丸有可能通过上调或下调相关的miRNA通过实时PCR显示基因阵列的结果可靠，综上所述，子宫肌瘤是个多因素参与、多路径调节的复杂过程.加味桂枝茯苓丸治疗子宫肌瘤的分子机制可能与影响了不同信号通路的miRNA表达有关，其具体机制仍有待进一步研究.

此外，基因芯片技术也较为广泛应用在抗心血管[30]，抗肿瘤[31]，抗抑郁[32]疾病药理作用机制研究中.十全大补汤是由10种草药制成的中药制剂，是一种营养剂，具有改善体内平衡紊乱和失衡的作用.此外，它还被证明具有抗肿瘤作用[33]，经常被临床医生用作癌症患者的替代药物.Zheng Hua-Chuan等[34]通过基因芯片科学阐明了中药十全大补汤的抗肿瘤作用和潜在的机制.基因芯片技术的应用不仅为研究新基因的功能提供了新思路，而且为中药作用机制研究开拓了新的技术平台.

3 中药新药研发及有效成分的筛选

新药的开发一般过程是根据疾病的发病机理，确定药物作用的靶点，建立相应的新药筛选模型，筛选不同来源的化合物，发现先导化合物，然后将其开发成新药[35].而中药特别是复方制剂其成分复杂多样，多种成分之间可能存在协同作用[36]，而传统的新药开发分析方法大多只是通过物理或化学方法进行分析某一组分或某一药理作用(生物碱、黄铜、皂苷等)通过细胞或动物模型等非临床研究手段进行药效药代毒理实验，忽视了多种成分之间产生的多重作用及中药整体观.此外，许多有效成分以微量形式存在，传统的分析技术难以筛选，这些都阻碍了中药新药研发的进程[15].因此，建立先进的研究手段是解决这类问题的必经之路，而基因芯片在中药研究领域的应用为中药有效成分研究提供了新方向.从基因水平来看，中药发挥其治疗效果就是通过对基因的表达调控起作用，从而调节机体部分或整体机能[37].基因芯片通过显示药物作用细胞组织的靶序列进行分析比较用药前后整个机体不同组织、器官的基因表达差异，并可实现实时监控药物调控细胞基因表达变化，从众多中药成分中快速筛选中药有效成分的目的.

目前基因芯片技术在中药有效成分筛选的应用正处在研究阶段，已有利用基因扩增技术发明出筛选对治疗或预防白癜风有效药物的方法，利用患者皮肤细胞用药前后基因扩增产物与正常皮肤细胞基因的电泳图进行比较分析，即可实现有效药物的筛选[38].此方法需要严格控制电泳条件，可能存在误差，可将疾病基因组掺入标记分子后，与正常基因芯片杂交，通过检测杂交信号强度，经数据比较分析后，可更加准确地筛选出有效药物.此外，Watanabe等[39]通过应用高密度寡核苷酸微阵列来分析银杏提取物对小鼠的皮层和海马的转录效应的影响，通过研究基因表达得知银杏提取物对神经元酪氨酸/苏氨酸磷酸酶1和微管相关的mRNA转录表达增强了3～4倍.全基因组表达监测在研究复杂提取物的生物学作用方面，可以从cDNA表达数据库中得到的肽库中制作肽芯片，从众多的药物成分中筛选到起作用的部分物质[15].在国内，已有利用基因芯片从知母中筛选得到了23种有效成分的报道[40].

4 中药复方研究

中药复方配伍的研究是中药现代化研究的又一关键科学问题.在中国，中药复方具有数千年的临床研究经验，形成了许多古老的中医药理论，如“升降浮沉”、“君臣佐使”等配伍理念均为我们所熟知，但其科学阐述一直是中药研究领域的难点[41].

利用基因芯片技术比较复方给药或单一有效成分给药前后组织基因表达水平的变化，可从分子调控水平分析复方中药的配伍作用情况.吕琳星等[42]利用基因芯片技术比较新双龙方及其两种有效成分人参总皂苷和总丹酚酸对急性心肌梗死大鼠的药理作用机制.通过大鼠全基因组表达谱芯片筛选出给药前及配伍药与单组分给药后的差异表达基因(Ratio>2或<0.5采用).结果表明，新双龙方与2种有效组分对心梗大鼠基因表达的影响不同，复方比组分的疗效更好，涉及更多通路，具有更积极的调控作用，从而证实了复方新双龙方的配伍优势.

清开灵的主要由栀子苷、黄芩苷组成，其配伍主要具有干预脑缺血损伤的作用，荆志伟等[43]通过基因芯片技术从16 463个小鼠脑测全基因组表达谱筛选出了32个差异表达的细胞黏附相关基因.通过对比结果显示栀子苷、黄芩苷及其配伍均能有效干预细胞黏附相关基因，但配伍后对细胞黏附相关基因干预能力大于单一组分，即配伍的整体疗效高于单一组分.这与该课题组前期的药效学(行为学、形态学)研究结果是一致的[44].用基因理论解释中医药理论，增加国际对中药复方的认可度，为中药的国际化发展提供理论保障.

5 中药质量控制与安全性研究

确保中药的质量与安全，是保证中医临床用药安全有效及可持续发展的前提.中药质量控制是能够准确地鉴别中药材，常采用形态观察、化学成分分析等方法，简便易行[45].但中药复方成分复杂，应用常规方法很难准确地鉴别其药用组分.可将基因芯片与从正品中药中得到的DNA杂交，得到标准基因图谱，与待鉴定中药的基因图谱比较分析即可达到鉴定的目的.

21世纪初，基因芯片首次被用于中药鉴定[46]，这为破碎药材、近缘相似种、炮制药材及贵重药材等的鉴别鉴定开辟了新道路.Tsoi等[47]将来自不同种属贝母基因组DNA中的26SrDNA基因D2与D3区的多态性片段进行扩增和测序，然后将其特异性寡核苷探针点固定在芯片上，制成基因芯片.用来自不同种属的荧光标记的与芯片杂交，不同种属的贝母将检测出不同的荧光信号，即可对贝母进行快速的种属鉴别与质量控制，史亚等[48]利用基因芯片技术研究考察了11种常见的中药饮片携带微生物情况，初步建立的中药饮片微生物基因库，检测包括真菌、细菌、病毒三类，检出174类微生物，其中不乏致病微生物，中药饮片中存在微生物污染情况，需要开展更深入的风险评估工作，完善中药饮片微生物数据库信息，保障中药饮片的用药安全.

Carles等[49]设计并制作了一种DNA芯片，用于鉴定有毒的中药材.将来自乌头、海芋、巴豆、曼陀罗、紫花曼陀罗、六角莲等18种有毒中药材的5SrRNA中的特异性寡核苷酸探针通过二硫醇键将探针固定在硅芯片上.扩增基因组靶序列并通过不对称聚合酶链反应进行荧光标记，通过平行基因分型鉴定多种有毒物种，这说明基因芯片是用作中药材的质量控制和安全监测的廉价且快速的工具.值得注意的是，中药的药效成分大多是其次生代谢产物，基因芯片只能鉴别中药的真伪而不能对其优劣进行鉴定，不能取代中药化学成分指纹图谱等的鉴定[50].

近年来，中药的安全性评价是中药现代化领域国内外探讨的热点问题.中药进入国际市场通常需要提供安全性研究报告，因此，中药毒性的快速评价与筛选是中药研究领域亟待解决的问题[51].传统的药理毒理研究方法很难进行较全面的评价，而且对于慢性毒性和不良反应，传统研究方法耗时长，需要大量人力物力，而且某些毒性和不良反应可能检测不到[52].利用基因芯片技术将中药的毒副作用与基因表达特征联系起来，通过基因的表达分析即可确定药物的毒性.1999年美国国家环境健康科学研究所(NIEHS)研究人员成功开发了基于基因组和DNA微阵列技术开发的分子生物学技术ToxChip，应用于确定天然和合成化合物的相对安全性，它将能够让科学家在分子水平上评估外来毒物的毒性，该技术对传统毒理学具有革命性意义[53-54].

6 中药基因组学的研究

中药基因组学是进行中药有效成分筛选、复方制剂研究、中药质量控制与安全性研究以至于中药基因芯片构建的基础与重要依据.

该学科是从基因组水平研究中药及其对人体作用的一门前沿学科，利用组学技术研究中药基原物种的遗传信息及其调控网络，阐明中药防治人类疾病的分子机制[55]，长期以来传统中药的应用主要研究方向集中在形态识别、化学物质基础揭示、药效作用分析、资源调查、人工栽培等方面[56]，但就更深层次的从分子生物学基因层面阐述中药及复方的药性研究，中药新药研发以及通过基因工程进行中药次生代谢产物合成等领域传统研究思路与方法很难具备用武之地，因此中药基因组学的研究基于分子生物学及基因组学两大学科，而基因芯片，DNA条形码等有关分子生物学、基因组学的先进技术极大地推动了利用药用植物鉴别领域的发展.

在丹参酮生物合成基因筛选研究中，崔光红[57]构建了首张丹参cDNA芯片，从4 354个cDNA克隆中得到114个在不同时期差异表达的独立基因，52个为丹参中首次报道.王学勇[58]通过诱导子处理丹参毛状根，采用cDNA芯片杂交，获得了诱导后48 h的差异基因转录谱，并克隆得到了5条与丹参酮生物合成相关基因.此项研究以中药基因组学基础通过构建高通量基因芯片从转录水平分析有关丹参酮翻译产物合成机制，为更深层次通过基因工程实现丹参酮人工生物合成提供理论基础.

7 基因芯片技术在中药现代化研究中的不足

诚然基因芯片技术可在中药作用机理、新药研发及有效成分筛分、复方研究及中药质量控制与安全性等方面，为现代化研究提供了全新的分析途径，并且推动了传统中医与现代医学的接轨，但不可否认该技术还存在许多不足有待发展完善，如基因芯片技术存在假阳性，基因芯片的特异性、检测系统的分辨率和灵敏度都有待提高，检测样品的制备及标记有待简化，基因芯片应用的成本较高限制了其应用的普及等.

8 展望

将基因芯片技术应用在中药现代化研究中，对克服由于中药化学成分复杂性及多样性导致难以解释作用机制等矛盾提出了新方案，为阐明中药的治病防病理论，提高在国际医学领域认可度有极大帮助.

要在中药现代化研究中，新药研发有效成份提取、复方制剂研究、中药质量控制与安全性研究等方面充分利用基因芯片技术，我们相信这样可以有效的刺激中药基因组学的发展，促进现代分子生物学及基因组学与中国传统中医文化相结合，有效为中医理论文化的继承与发展提供支撑，并且通过提高中药道地性形成研究、解释中药遗传机制与药性相互作用，研究保护品种稳定性的方法，建立中药优质品产地及基因组相关数据库，完善中药材野生资源保护机制，保护中药品种和遗传信息资源这一国家战略资源.

综上所述，现代分子生物学及基因组学的持续研究造就了近30年基因芯片技术的不断发展，而中药现代化发展借助此项技术取得了的举世瞩目成就，可以预见其发展和应用前景极为广阔.目前，从分子水平研究中药最为高效率、高通量的技术手段依然是基因芯片技术，为中药现代化研究提供了新的发展空间.未来，随着该技术的完善，其在中药研究领域也将更为广阔.