Neuritin 神经可塑性机制研究

赵秋语，陈 黎，胡 敏

（昆明医科大学第四附属医院暨云南省第二人民医院眼科/云南省眼部疾病临床医学研究中心/云南省眼科研究所/云南省眼病临床医学中心，云南 昆明 650021）

神经氨酸（Neuritin）最初是在海藻酸诱导的海马齿状回中发现的一种与神经可塑性相关的神经营养因子，因其编码的蛋白质能够促进神经突起的快速生长而得名，也被称为候选可塑性相关基因15（candidate plasticity-related genes15，CPG15）[1，2]。作为一种神经营养因子，Neuritin 在神经系统中发挥着许多作用，其中神经可塑性及机制的研究备受关注。弱视是目前我国常见视觉障碍中的一种[3]，近年来研究显示弱视的发生与视觉神经通路的发育异常有着密切关联[4，5]。但现今弱视的治疗方案多为压抑优势眼、屈光矫正及视觉训练，甚少有关于视觉神经通路可塑性药物治疗方面的研究，Neuritin 的神经可塑性可能为弱视及其他视觉系统损伤疾病提供新的治疗思路。

1 Neuritin 对神经系统的作用及机制

Neuritin 是神经活动和神经营养因子家族（NTs）共同作用的下游因子。在早期胚胎发育过程中，Neuritin 在大脑多个区域表达，并充当神经祖细胞和分化神经元的生存因子[6]；发育的后期，Neuritin促进轴突和树突状树突的生长和稳定以及突触形成和成熟[7，8]；成人大脑中，Neuritin 持续表达，其表达与活动依赖的功能的可塑性相关[9]。因而Neuritin 在神经可塑性领域有着良好的应用前景。

1.1 抑制细胞凋亡，促进神经损伤后的恢复 Zhang H 等[10]认为Neuritin 在蛛网膜下腔出血（SAH）后可通过减轻血脑屏障破坏、脑水肿和细胞凋亡对早期脑损伤（EBI）发挥神经保护作用，而这种作用可能是通过抑制内质网应激（ERS）介导的凋亡途径来实现。Gao R 等[11]发现Neuritin 在实验性大鼠脊髓损伤（SCI）模型中创造了促进神经细胞存活和神经突再生的环境，从而有助于神经再生和运动功能的恢复。另一实验研究也证明[12]，Neuritin 治疗不仅增加了坐骨神经损伤中的坐骨纤维密度和组织以及髓鞘再生程度，而且还促进了腓肠肌肌肉力量和神经传导速度恢复。最近的研究显示[13]，Neuritin 可通过改善施万细胞的存活率和功能从而改善大鼠糖尿病性神经病中神经元的生长。以上研究证明，Neuritin 在中枢及周围神经中均有明显的促进损伤修复作用，但具体的修复机制仍有待探究。

1.2 促进突触发育及神经元迁移 有研究者为了研究突触成熟过程中对Neuritin 的需求，建立了一个CPG15 基因敲除（CPG15 KO）小鼠模型，发现这些小鼠的轴突和树突状树突形成存在明显的发育延迟[14]。电生理研究还表明，突触的成熟被延迟，电子显微镜发现许多树突棘最初都缺乏功能性的突触接触。Subramanian J 等[15]发现Neuritin 可通过募集突触后致密蛋白（PSD95）促进兴奋性突触的稳定和成熟。他们利用双光子成像观察到Neuritin 利用其糖基磷脂酰基醇锚（GPI 锚）与AMPA 受体（AMPAR）相互作用可使PSD95 募集到新生的棘突从而促进神经元细胞轴突的生长及突触的成熟，而PSD95 募集反过来会促进AMPA 受体与未成熟突触的接触，从而产生结构稳定且功能成熟的突触。此外也有研究表明[16]，Neuritin 能够促进神经元细胞的迁移,实验发现Neuritin 在永生的神经元（GN11 细胞）迁移的小鼠模型中高表达，而在非迁移的神经元（GT1-7 细胞）中没有表达。同时，当Neuritin 过表达或者沉默时，GN11 细胞出现了相对应的迁移增强或减弱。这些结果提示Neuritin 在神经系统的发育和成熟过程中起着不可替代的作用。

1.3 参与神经可塑性的调控 唐娟等[17]观察到Neuritin 可使DRG 和PC12 细胞出现浓度依赖性的神经突增生。在NGF 的诱导下Neuritin 能使DRG 和PC12 细胞表现出更强的分化作用，其细胞突起数量及长度明显增加，相反，在缺乏Neuritin 的培养环境下几乎观察不到神经突生长。在大鼠抑郁症模型中海马神经元树突分支减少，同时Neuritin 基因在海马神经元中的表达由于慢性不可预测的压力（CUS）而降低，而病毒介导的Neuritin 蛋白在海马中的表达可防止CUS 引起的树突和树突棘萎缩[18]。

近年来，有研究者发现Neuritin 蛋白可能在听觉剥夺的情况下对上橄榄岩旁核（SPON）神经元的存活和发育起重要作用[19]。SPON 神经元在动物发声和人类语音中编码节奏信息起重要作用，他们发现与正常听觉的小鼠相比，在耳聋小鼠的SPON 中可溶性的Neuritin 被上调，膜时间常数减少和Ca2+电流的募集减少，从而使听觉剥夺小鼠的精确反弹峰值正常化，推测Neuritin 可能促进了神经元的存活并延长了SPON 电路的可塑性。以上这些研究表明Neuritin 在神经可塑性中起重要作用。

2 Neuritin 分子生物学特性

2.1 Neuritin 基因的表达调控 在神经系统中，神经活动和神经营养因子均能单独诱导Neuritin 的表达，但二者诱导Neuritin 表达的分子机制明显不同。Neuritin 是许多经典突触可塑性信号级联反应的下游因子[20]，包括N 一甲基一天冬氨酸（NMDA）受体、促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）、钙离子及钙调蛋白依赖的蛋白激酶（CaMK）和cAMP 反应结合蛋白（CREB）。目前认为，神经活动可以通过激活NMDA受体或者直接使L 型电压敏感钙通道（VSCCs）开放，钙离子内流，进一步激活钙离子及钙调蛋白依赖的蛋白激酶CaMK 和MAPK 通路，最终促使一系列的转录因子包括CREB 激活，并与Neuritin 基因的启动子结合启动转录。

多种神经营养因子均能单独诱导Neuritin 蛋白的表达，表明Neuritin 是NTs 发挥作用的共同下游因子。在成年大鼠的齿状回中外源性注入脑源性神经营养因子（BDNF），观察到Neuritin mRNA 的表达上调[21]。在神经元祖细胞（ST14A）中过表达神经胶质源性神经营养因子（GDNF），发现Neuritin 等基因表达上调[22]，推测GDNF 通过诱导Neuritin 的表达从而参与神经组织的发育和维持。

除以上因素外，雄激素及HuD 蛋白也与Neuritin 基因的表达有关。有实验发现使用睾丸激素治疗可使神经损伤的仓鼠体内的NeuritinmRNA 水平增加数倍，而使用氟他胺（雄激素受体阻滞剂）同时治疗时NeuritinmRNA 并没有出现变化[23]，这证实雄激素是通过雄激素受体对Neuritin 基因的表达进行调节。HuD 是Hu 蛋白家族中一种神经特异性的mRNA 稳定性调控因子，有研究显示[24]，HuD 可以直接与Neuritin 结合并稳定Neuritin mRNA，提示HuD可能参与了Neuritin mRNA 的稳定性调控。

通过以上研究结果可发现Neuritin 的表达受到多方面的调控，但目前对于各个调控通路之间是否相关或相互影响并未见相关研究。

2.2 Neuritin 相关信号通路及分子机制 尽管已知Neuritin 通过与受体结合发挥非细胞自主作用[7]，但就目前而言，Neuritin 仍被认为是一种孤儿配体，尚未确定特定的Neuritin 受体，下游效应因子尚不清楚。

2.2.1 Neuritin 与胰岛素受体（IR）有研究表明[25]，将小脑颗粒神经元（CGNs）与Neuritin 一起培养可增加CGNs 在时间和浓度依赖下瞬时外向钾电流（IA）的密度，这些变化是由Kv4.2（IA 通道的主要亚基）转录和翻译的增强而引起。将胰岛素注射到CGNs也可以诱导IA 密度增加以及Kv4.2 表达增加，从而推测Neuritin 引起的Kv4.2 表达增强可能与IR 激活有关。生化分析表明，Neuritin 可以激活IR，而通过药理学阻断IR 可完全抵消Neuritin 引起的作用。尽管缺乏证据表明Neuritin 可直接与IR 结合，但以上的研究结果表明Neuritin 可能是IR 的潜在配体。

2.2.2 Neuritin 激活丝裂原激活的蛋白激酶-细胞外信号调节激酶（MEK-ERK）和PI3K-Akt-mTOR 通路 ERK 通路是NGF 和IR 信号转导的靶标。Ying Y 等[25]将CGNs 与Neuritin 一起培养30 min 可增加ERK1/2 的磷酸化，而加入MEK/ERK 通路阻滞剂U0126 后，由Neuritin 介导的IA 的密度增加以及Kv4.2 的表达增加都被逆转。与ERK 相似，孵育过程中Akt 和mTOR 的磷酸化均增加，但二者反应速度不同且均慢于ERK，同样，加入相应阻滞剂后可逆转Neuritin 介导的反应。

2.2.3 Neuritin 激活NFATc4/Ca2+/CaN 通路 Zhao QR等[26]利用钙成像和蛋白质印迹分析发现Neuritin 可增强高K+诱导的细胞内Ca2+水平的增加，并刺激CaV1.2 和CaV1.3（L 型钙通道的亚基）的细胞表面表达，进而抑制IR 或促分裂原激活的蛋白激酶激酶/ERK。也有其他研究称，Neuritin 可能是刺激CaV3.3α（T 型钙通道的亚基）的细胞表面表达[27]。利用L 型钙通道抑制剂、钙调蛋白和钙调神经磷酸酶（CaN）可消除Neuritin 对神经突长度和脊柱密度的影响。另外，通过沉默活化的T 细胞核因子（NFAT）c4 也获得了相似的结果，而该因子在CGNs 中可被Neuritin 激活[28]。

综上所述，Neuritin 可能通过IR、ERK/PI3KAkt-mTOR 通路以及NFATc4/Ca2+/CaN 导致Kv4.2上调并增加IA 密度，进而对CGN 中神经突和脊柱生长产生影响。

2.2.4 其他信号通路 李贺等[29]建立神经元样Neuro-2a（N-2a-N）细胞损伤模型，发现Neuritin 能够上调并激活ERK1/2 和信号转导及转录激活因子3（STAT3），进而介导白血病病毒前病毒插入位点1（Pim-1）和GAP-43 蛋白表达，促进受损N-2a-N细胞神经突起的再生。Shimada T 等[30]发现Neuritin与成纤维细胞生长因子（FGF）共同作用可以减少苔藓纤维的生长，而这一过程是通过FGF 通路引发的。在实验性糖尿病性神经病中，Nan G 等[31]发现Neuritin 与酪氨酸激酶A（TrkA）受体共同定位于大鼠DRG 神经元中，然而目前并没有直接的证据表明神经氨酸激活了TrKA 受体。Pan Z 等[32]发现Neuritin和神经化的E3 泛素蛋白连接酶1（NEURL1）（Notch调节剂）之间存在相互作用。重组Neuritin 恢复了由Notch 激活引起的神经突回缩，而Neuritin 刺激的神经突生长被NEURL1 部分阻滞，这提示Neuritin 是NEURL1 的上游和负调节剂，可抑制Notch 信号传导从而促进神经突生长。

3 Neuritin 与视路

3.1 Neuritin 在视路中的分布 Neuritin 在视路中广泛表达，主要分布在视网膜、视神经、外侧膝状体、视皮层及视上丘[2]。在视网膜中Neuritin mRNA 仅在视网膜神经节细胞层中被检测到，且集中于轴突。Fujino T 等[33]搜索到了一个称为CPG15-2 的潜在旁系同源物。CPG15-2 也是一个活性调节基因，其基因组结构与CPG15 相似，但二者分布区域不全相同。与CPG15 在大脑皮层和海马中的含量最高相反，CPG15-2 mRNA 在视网膜和嗅球中含量最高。在视网膜中，CPG15 集中于视网膜神经节细胞（RGCs），而CPG15-2 主要在双极细胞中表达。但是迄今为止，还缺乏关于CPG15-2 的研究。

3.2 Neuritin 基因表达在视路发育过程中的变化 通过原位杂交的方法分别观察猫和大鼠从视觉发育初期到成年期全过程中初级视皮层Neuritin mRNA 表达变化，发现Neuritin 基因表达高峰出现在视觉发育关键期[34，35]。陈霞等[36]观察到正常发育大鼠视皮层中的Neuritin mRNA 和蛋白表达与视觉经验和年龄有关，在视觉发育关键期达到高峰，且单眼形觉剥夺会明显影响视皮层中Neuritin 的表达。这些研究均表明Neuritin 基因可能参与视觉神经系统发育的全过程，并且在视觉发育关键期参与视皮层神经元可塑性的调节，由此可推测Neuritin 是参与视觉发育可塑性变化的分子基础之一。

3.3 视路可塑性与Neuritin 基因的表达调控 研究表明[37]，Neuritin 在大鼠视觉皮质的表达具有光诱导性。将正常大鼠置于黑暗环境2 周后，其视皮层中的Neuritin 表达减少，而给予光刺激4 h 后其表达又回复到原来的正常水平。但有研究发现[35]，Neuritin 基因表达调节分为两个阶段：早期的表达虽与睁眼时间相吻合，但并不受暗环境、视网膜驱动动作电位或单眼剥夺的影响，表达相对独立；在视觉发育关键期，Neuritin 表达的活性依赖成分出现，并且随着年龄的增长，视网膜动作电位阻滞的作用变得更加明显。

伟伟等[38]在大鼠视神经损伤模型中发现Neuritin 基因在受损视神经中表达上升，而Neuritin 基因过表达可提高RGCs 的活性。另一研究报道称[39]，Neuritin 在体外和体内轴突损伤后对神经切除的RGCs 均表现出神经保护、再生作用并保留了RGCs功能，研究者通过腺相关病毒（AAV）介导的Neuritin 过表达延迟了RGCs 凋亡，再生了受损轴突并维持了视神经损伤后RGCs 的功能，从而支持了Neuritin 的视神经保护作用。Huang T 等[40]对Neuritin 对视神经损伤的修复机制进行进一步研究，认为Neuritin 的功能性分子激活了Akt1 和STAT3 途径，并抑制了线粒体的凋亡途径。Azuchi Y 等[41]研究了视神经损伤（ONI）对Neuritin 基因敲除（KO）小鼠视网膜变性的影响。在ONI 小鼠模型中Neuritin mRNA 上调，对于剔除Neuritin 基因的成年小鼠，其视网膜结构和RGCs 数量正常，而剔除Neuritin 基因小鼠的ONI 模型显示RGCs 死亡和视网膜内部变性更为严重，提示Neuritin 蛋白促进了损伤后RGCs存活和轴突再生。Picard N 等[42]指出，小鼠胚胎时期Neuritin 的整体敲除会导致出生后视觉皮层中兴奋性网络的异常发育以及相关视觉感受野特性发展中断。此外，尽管重复的视觉刺激会引起野生型小鼠视皮层细胞反应的增强和抑制，但Neuritin 基因敲除小鼠抑制却较慢，表明短期抑制机制的损害。

以上研究显示在不同的损伤模型中，Neuritin可以在不同阶段被下调和上调，但是神经损伤后Neuritin 总体水平会增加，表明Neuritin 在视觉系统神经可塑性中起到重要作用。

4 总结

目前弱视的定义仍在强调临床检查无可见器质性病变，但已有研究可以证明弱视的视网膜超微结构出现变化，并且具有一定的可塑性和可塑期，具体机制尚不清楚。Neuritin 目前虽然较少应用于弱视研究，但通过探究Neuritin 的神经可塑性与视路可塑性的关系可以发现，其分布与弱视的解剖变化部位有重合，且其表达变化与视觉关键期的形成一致，推测Neuritin 可能作为重要的一环参与了弱视的形成。因此对于Neuritin 的深入研究可能为今后弱视的发病机制及药物治疗的研究提供新的思路。