血小板膜受体脱落的研究进展

顾亚娟，孟照辉

(昆明医科大学第一附属医院心内科分子心血管病研究室，昆明 650032)

血小板在维持血管壁完整性以及生理止血过程中发挥重要作用。当血管受损时，内皮下的胶原暴露，血小板黏附至血管损伤部位，进一步发生血小板活化、聚集以及释放凝血因子，最终形成血小板血栓[1]。血小板黏附、聚集的发生主要通过其表面的膜蛋白实现。血小板膜上有多种具有受体功能的糖蛋白(glycoprotein，GP)，这些膜受体主要在信号转导通路中发挥接受和转导信息的作用。血小板膜蛋白作为受体与血管性血友病因子、凝血酶或胶原、层粘连蛋白等结合，将一系列信号转导至细胞内，刺激血小板发生形态改变、分泌释放各种因子以及促进血小板聚集[2]。因此，血小板膜受体功能异常很大程度上会影响血小板的信号转导。近年来，血小板膜受体从膜表面脱落的现象引起了人们的关注。研究表明，脱落是蛋白水解酶对膜受体的酶切作用，血小板膜受体有特定的“脱落酶”[3]。血小板膜受体的脱落会使血小板的黏附、聚集、释放等特性发生改变。检测膜受体脱落下来的片段一定程度上可以反映血小板的功能变化。目前已发现多种膜受体会发生脱落，其中包括黏附受体、整合素以及黏附分子等[4]，现就血小板膜受体脱落的研究进展进行综述。

1 脱落与脱落酶

受体脱落是指跨膜受体在细胞膜表面发生不可逆的降解。在生理、病理因素作用下，蛋白水解酶作用于膜表面受体，产生可溶性的胞外片段和膜上残余片段[5]。血小板膜受体脱落能调节表面受体的表达，降低受体的表面密度，导致受体与配体结合丧失，影响信号转导，从而调控血小板功能。

受体脱落是一种蛋白水解过程，这个过程需要酶的参与，称这种酶为“脱落酶”。目前 “脱落酶”主要包含解整合素金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase，ADAM)家族成员、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)家族成员以及钙蛋白酶，其中ADAM与MMP主要在细胞外对血小板膜蛋白受体发挥水解作用，钙蛋白酶则是在细胞内参与调节血小板表面受体的脱落[3]。ADAM负责大部分跨膜蛋白的脱落，属于Zn2+依赖的跨膜金属蛋白酶超家族，由多个结构域复合而成，包括N端信号序列、前结构域、金属蛋白酶结构域、崩解素结构域、富含半胱氨酸的区域、类表皮生长因子结构域(ADAM10和ADAM17除外)、跨膜结构域和细胞质尾[6]。人类基因组共鉴定出22个ADAM家族成员，其中有12个(ADAM8、9、10、12、15、17、19、20、21、28、30和33)编码蛋白活性酶，目前研究较多的是ADAM10和ADAM17[7]。ADAM10和ADAM17能切割具有不同功能的底物，其中ADAM10至少有40种底物[8-9]。血小板上的ADAM10底物包括GPⅥ、GPⅤ、CD44、CD84、淀粉样前体蛋白和表皮生长因子，ADAM17的底物主要是GPⅠbα和GPⅤ[7]。ADAM切割膜蛋白的过程中，四跨膜蛋白(tetraspanins，Tspan)作为“伴侣”分子发挥了调节作用[10]。研究证实，Tspan14在人和小鼠的血小板中表达，Tspan14过表达抑制了ADAM10的切割，保护静息血小板上GPⅥ免受ADAM10的切割而不脱落[11]。Tspan5能促进CD44脱落，而Tspan15则抑制淀粉样前体蛋白脱落[12]。除Tspan会影响膜蛋白受体的脱落外，ADAM的自身活性也有重要作用。虽然对于ADAM活性的调控机制尚不清楚，但快速激活ADAM10和ADAM17依赖于跨膜结构域而不是细胞质尾，其活性可因细胞内Ca2+水平的升高而上调[13]。也有证据表明，ADAM10可能通过改变底物的细胞内信号介导膜受体的脱落，黏附分子CD44的磷酸化可导致其胞外结构域发生构象变化，使之更容易脱落[14-15]。

2 多种血小板膜受体的脱落

2.1GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ复合物由4个跨膜糖蛋白(GPⅠbα、GPⅠbβ、GPⅨ和GPⅤ)组成，4个亚基均属于富含亮氨酸重复序列的蛋白质家族[16]。GPⅠbα通过二硫键与GPⅠbβ连接形成GPⅠb，然后GPⅠb再以非共价方式与GPⅨ和GPⅤ相连，最终形成复合物[17]。GPⅠbα是该受体复合物的主要配体结合亚基，由1个球形N端配体结合结构域、1个唾液酸核心、1个跨膜结构域和1个细胞质尾组成[18]。GPⅠbα能够结合多种配体，与血管性血友病因子结合介导血小板黏附的发生。此外，GPⅠbα的胞外域还能与FⅪ、FⅫ、凝血酶、高分子量激肽原、血小板反应蛋白、白细胞整合素αMβ2和P-选择素等多种配体结合，在凝血和免疫调节中发挥重要作用[19]。因此，GPⅠbα胞外结构域的完整性对其功能的正常发挥至关重要。GPⅠbα膜近端序列包含血小板脱落酶的切割位点，ADAM17是其主要脱落酶[20]。将GPⅠbα的膜近端序列(Lys450-Phe483)合成肽与ADAM17作用后进行质谱分析发现，ADAM17能在Gly464/Val465位点切割GP Ⅰ bα[21]。在脱落酶的作用下，GPⅠbα的N端断裂释放出可溶性的GPⅠbα片段。免疫印迹可在静息状态的洗涤血小板上检测到完整的GPⅠbα、GPⅠbα的N端脱落片段以及残存的C端片段[21]。

2.2GPⅥ GPⅥ属于免疫球蛋白超家族成员，由2个胞外免疫球蛋白结构域、1个短黏蛋白结构域、1个膜近端序列、1个跨膜结构域和1个细胞质尾组成[1]。GPⅥ通过与FcRγ结合形成复合物发挥作用，FcRγ含有免疫受体酪氨酸激活基序，免疫受体酪氨酸激活基序激活Syk激酶并启动下游信号通路，导致血小板分泌ADP等激动剂，进一步使血小板活化、聚集[22]。胶原、胶原相关肽、惊厥蛋白等与GPⅥ结合后活化血小板，激活蛋白水解通路，导致GPⅥ的胞外域脱落。研究表明，GPⅥ胞外膜近端序列包含一个脱落酶切割位点，参与GPⅥ蛋白水解的脱落酶是ADAM10，免疫受体酪氨酸激活基序激活导致GPⅥ被ADAM10切割[22]，切割后产生一个约55 kDa的可溶性GPⅥ片段和约10 kDa的膜相关残余片段[21]。由于GPⅥ的脱落具有金属蛋白酶依赖性，激活或抑制金属蛋白酶的活性会影响GPⅥ脱落。变性剂N-乙基马来酰胺可直接激活ADAM10诱导GPⅥ脱落，也可通过钙调蛋白抑制剂抑制钙调蛋白对金属蛋白酶的调控作用，诱导GPⅥ脱落；而乙二胺四乙酸、广谱的金属蛋白酶抑制剂GM6001、肿瘤坏死因子以及磷脂酰肌醇激酶、Syk激酶等GPⅥ信号转导相关的抑制剂则会阻断GPⅥ的脱落[23]。

2.3整合素 整合素是血小板膜上的黏附受体，主要发挥作用的是αⅡbβ3，通过与血管性血友病因子、纤维蛋白原或其他配体结合介导血小板聚集，从而在血栓形成过程中发挥关键作用。目前发现，在血小板内，钙蛋白酶对整合素β3有水解作用[24]。钙蛋白酶能切割β3的细胞质尾部，即水解NXXY基序，这段基序对于配体结合、双向信号的转导以及细胞骨架的连接有重要作用[25]。关于血小板表面整合素的脱落尚未被广泛探讨，但在其他细胞表面发现存在整合素脱落现象，对白细胞整合素αLβ2的研究表明，一个未确定的蛋白酶既能切割β2的膜近端区域，又能切割αL释放一个可溶性的胞外片段[26]；在巨噬细胞中，MMP-9能使整合素β2亚基脱落[27]。因此推测血小板表面可能也存在整合素脱落，但发挥作用的脱落酶以及脱落后对血小板功能有无影响有待深入研究。

2.4血小板内皮细胞黏附分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1) PECAM-1是在血小板和血管内皮细胞上表达的糖蛋白受体，具有黏附和信号转导的特性。PECAM-1由胞外免疫球蛋白结构域、跨膜结构域和细胞质尾组成，胞质结构域含有一个免疫受体酪氨酸抑制基序，承担信号转导的作用[28]。PECAM-1的脱落在内皮细胞和血小板中均有发生。在内皮细胞中，PECAM-1在细胞凋亡过程中被caspase和MMP切割[28]；在血小板中，高剪切应力下血小板上表达的PECAM-1发生裂解脱落，钙蛋白酶切割PECAM-1的免疫受体酪氨酸抑制基序的上游，从而使受体失活[29]。PECAM-1的脱落受钙调蛋白调节，在细胞质尾部的近膜区域含有一个钙调蛋白结合序列，钙调蛋白抑制剂可诱导PECAM-1的水解脱落[30]。PECAM-1的脱落对血小板功能的影响仍有待深入研究。有研究表明，PECAM-1能负性调控血小板-胶原的相互作用，PECAM-1缺陷小鼠的血小板对胶原蛋白刺激的血栓形成反应增强[31]，推测PECAM-1脱落可能也会影响血栓的形成。

2.5癌胚抗原相关细胞黏附分子1(carcinoembryonic antigen related cell adhesion molecule 1，CEACAM1) CEACAM1是癌胚抗原超家族的一员，属癌胚抗原相关细胞黏附分子类，是广泛表达于免疫细胞、血液细胞、上皮细胞以及内皮细胞的Ⅰ型跨膜受体，主要介导细胞间的同质黏附和异质黏附[32]。Wong等[33]发现，与野生型相比，CEACAM1-/-小鼠的血小板Ⅰ型胶原介导的血小板聚集、颗粒黏附和分泌增加；在胶原和肾上腺素诱导的小鼠急性肺血栓模型中，CEACAM1-/-小鼠较野生型小鼠更易发生肺血栓栓塞。以上研究表明，CEACAM1是血小板-胶原相互作用的负调节因子，缺乏CEACAM1会影响血小板的功能，进而影响血栓形成。既往研究发现，细胞凋亡可导致CEACAM 1胞内段和胞外段双脱落，caspase-1、3、7介导凋亡细胞CEACAM1的脱落[34-35]。此外，MMP可能也介导CEACAM1脱落。研究表明，人血小板表达MMP-12，MMP-12可在几个位点切割CEACAM1胞外段并产生若干短肽，在这些片段中，WYKG可促进Ⅰ型胶原诱导血小板α颗粒分泌[36]。进一步研究发现，MMP-12切割CEACAM1后产生的另一个短肽QLSN能抑制GPⅥ介导的血小板活化，显著减轻胶原诱导的血小板黏附、聚集[37]。上述研究表明，脱落产生的片段仍然可能具有活性，在调控血小板功能上发挥重要作用。

2.6其他膜蛋白受体的脱落 循环系统中的CD40L主要存在于血小板中，活化的血小板表面表达CD40L，裂解后可产生可溶性CD40L片段。与CD40L脱落直接相关的酶尚未被清楚地识别出来，但研究发现，MMP-2与整合素αⅡβ3相互作用后能使CD40L脱落，并且增强血小板的活化[38]。人血小板表达的免疫细胞受体信号素4D(semaphoring 4D，Sema4D)参与调控血栓形成，在动脉血栓模型中，缺乏Sema4D的小鼠表现出闭塞性血栓减少，表明在佛波酯、胶原或其他激动剂激活的血小板上，Sema4D的表达增加，促进血栓形成；随后在MMP的介导下，Sema4D脱落释放一个可溶性胞外片段，影响了血栓的继续形成[39]。另外，G蛋白偶联受体也可能受MMP依赖的细胞外蛋白水解途径的调节，蛋白激活受体-1是凝血酶的G蛋白偶联受体，N端胞外结构域在ADAM17介导下脱落[40]，但其生理作用目前尚不确定。

3 血小板膜受体脱落的临床意义

血小板膜受体的脱落可下调血小板表面受体的密度，进而影响血小板的生理功能，在血栓形成、血小板衰老及清除中起重要作用，脱落的胞外片段可能成为潜在的血小板特异性生物标志物。

血小板膜受体的表面密度与血栓形成和出血风险相关，血小板膜受体的脱落可能导致血栓形成风险降低、出血风险增加。GPⅥ与胶原和层粘连蛋白结合，介导血小板的释放、聚集，GPⅥ缺失不利于血栓形成[41]。血小板表面GPⅥ缺陷小鼠可能导致无法维持稳定的血管闭塞[42]。血栓稳定性降低的原因可能与胶原和纤维蛋白结合减少，以及产生凝血酶的能力降低有关。在血小板表面缺乏GPⅠbα胞外域表达的转基因小鼠中，血栓形成明显受损[43]，表明血小板表面GPⅠbα的脱落可能会对血栓形成产生一定的影响。研究表明，机械循环支持下的重症患者血小板表面的GPⅠbα和GPⅥ减少，GPⅠbα和GPⅥ的脱落可通过抗血栓形成而增加出血风险，血浆可溶性胞外片段中GPⅥ的升高，有助于评估接受左心室辅助装置治疗心力衰竭患者的出血风险[44]。人血浆可溶性GPⅥ水平升高可由多种潜在原因造成，包括胶原暴露增加，炎症、代谢紊乱或感染引起的血小板高反应性，动脉狭窄或其他原因引起血流动力学和剪切应力改变，凝血病以及抗血小板抗体相关的自身免疫性疾病[45]。在心脑血管疾病方面，血浆可溶性GPⅥ水平在动脉粥样硬化性疾病中存在显著差异，包括脑卒中、冠状动脉疾病、心房颤动、合并单支血管狭窄的冠心病、弥散性血管内凝血和血栓形成性微血管病变[46-50]。可溶性GPⅥ可能成为反映个体血小板相关变化的更敏感的标志物。

此外，血小板膜受体的脱落与血小板的衰老、清除有关。正常循环中的血小板存在一定比例的GPⅠbα水解脱落，这些脱落的GPⅠbα片段在一定程度上反映了血小板功能。研究表明，GPⅠbα的脱落与冷藏血小板的清除机制有关，GPⅠbα的脱落影响受体的密度，进而影响血小板与吞噬细胞的相互作用，从而调节清除[51]。除冷藏血小板会发生GPⅠbα脱落外，实验损伤或老化的血小板也会发生脱落[20,52]。因而GPⅠbα脱落可能是血小板老化的一个标志。与GPⅠbα不同，GPⅥ水平较稳定，在正常循环血小板中仅检测到GPⅥ的完整形态，未检测到GPⅥ的水解脱落片段[21]。但血小板在储存过程中GPⅥ逐渐降低，与其脱落水平的增加有关[53]，GPⅥ的逐渐脱落减弱了血小板的黏附和聚集特性[54]。

4 结 语

血小板功能的发挥离不开膜受体，既往研究主要集中于血小板膜受体的激活及其对应的信号通路，这些受体的下调机制较少被关注。脱落是血小板膜受体的下调机制之一。膜受体在膜表面附近被脱落酶切割，随后将脱落片段释放入血浆。目前已发现多种血小板膜受体会发生脱落，这些受体的脱落导致受体水平失衡，导致血小板受体与其相应配体无法正常结合，不同程度地影响受体介导的血小板活化、黏附、释放、聚集等过程，进而影响血小板的止血功能，表明血小板膜受体的脱落可能为抗血小板、抗血栓治疗提供新的途径。另外，受体脱落的结果是可溶性片段的生成，这意味着这些血浆可溶性片段很有可能作为调节因子发挥作用，或成为反映个体血小板状态的特异性生物标志物。但目前对血小板膜受体的脱落机制及其影响仍缺乏全面认识，对其进一步深入研究有助于阐明血小板的病理生理变化。