Piwil样蛋白2、细胞信号传导和转录激活因子3在恶性乳腺叶状肿瘤组织中表达及临床意义

李 伟， 李双霞， 孟元华， 李凤玉， 张奇芳， 熊正文， 田玉旺， 牛晓东

陆军第八十一集团军医院1.病理科；2.检验科；3.肿瘤科；4.麻醉科，河北 张家口 075000；5.张家口市第一人民医院 超声科，河北 张家口 075000；6.解放军总医院第七医学中心 病理科，北京 100700

乳腺叶状肿瘤(phyllode tumor of the breast，PTB)[5]由上皮成分与纤维结缔组织组成，呈分叶状，根据世界卫生组织肿瘤标准分为良性、交界性与恶性3种类型[1-2]。PTB临床症状为单侧无痛硬质包块[3]。恶性PTB发病率极低，占比22%左右，好发于中年女性，并且部分患者肿瘤生长期漫长，可达多年，并且具有较高的局部复发与远处转移的风险[2]。PTB的组织学分级与预后相关，进一步明确PTB预后相关因素具有重要意义[4]。Piwil样蛋白2(P-element-induced wimpy testis like 2，Piwil2)属于PIwI亚家族成员之一，在自我发育更新、RNA转录调控机制以及诱导沉默中具有重要意义[5]。Piwil2可通过抑制细胞凋亡，促进癌症的发生，在多种癌组织中异常高表达[6-7]。细胞信号传导和转录激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3，Stat3)为STAT家族成员之一，与癌症等多种疾病的发展有关。有研究显示，Stat3高表达可促进肿瘤的生长与增殖[8]。目前，国内外关于Piwil2、Stat3与恶性PTB相关性的研究较少。本研究通过检测Piwil2、Stat3在恶性PTB组织中的表达情况，分析二者与恶性PTB的相关性，以期为恶性PTB的临床分析及判断患者术后复发、转移情况提供参考依据[7]。现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 将自2000年3月至2012年6月陆军第八十一集团军医院和解放军总医院第七医学中心收治的153例女性PTB患者的乳腺组织纳入PTB组。纳入标准：符合2012年世界卫生组织恶性叶状肿瘤诊断标准[9]；均为首次接受住院治疗；术前未进行其他辅助性治疗。排除标准：近期进行过化疗或手术等治疗；合并其他免疫系统疾病者。另将同期收治的70例乳腺炎患者切除的乳腺正常组织纳入对照组。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂及方法 兔抗人Piwil2多克隆抗体(PAB27177)购自艾美捷科技有限公司；Stat3多克隆抗体(ABP0124)购自亚科因(武汉)生物技术有限公司；DAB显色剂(CTS010)购自上海嵘崴达实业有限公司；磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)购自上海一基实业有限公司。对照组取术中切除的乳腺正常组织作为样本，PTB组取手术切除肿瘤组织作为样本。生理盐水冲洗组织样本，甲醛固定，石蜡包埋，切片厚度5 μm，二甲苯进行脱蜡、水化、PBS冲洗5 min。根据试剂盒说明书进行SP法染色，再采用苏木精复染、重新水化后封片观察。

1.3 结果判定及随访 根据染色强度进行分类：未染色0分，染色弱阳性1分(淡黄色)，染色强阳性3分(黄褐色)，弱阳性与强阳性之间的阳性染色为2分。根据阳性细胞占比可分为：占比≤5%为0分；5%<占比<25%为1分；25%≤占比≤50%为2分；占比>50%为3分[10]。两项评分乘积即染色指数(staining index，SI)：阴性(-)，SI≤1；弱阳性(+)，1

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0统计学软件对数据进行处理。计数资料用例(百分率)表示，组间比较采用χ2检验。采用Spearman秩相关分析检验Piwil2、Stat3表达在恶性PTB组织中的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTB术后随访情况 PTB患者共153例(71例良性PTB、32例交界性PTB、50例恶性PTB)，肿瘤复发共18例(2例良性PTB、6例交界性PTB、10例恶性PTB)，无复发135例。采用肿物单独切除术、肿物扩大切除术、乳房切除术对患者进行治疗，共有6例患者于术后2～38个月内死亡(1例交界性PTB、5例恶性PTB)，其中4例发生不同程度的肺部、骨骼转移致死，2例复发性致死；良性PTB患者5年内未发生转移和死亡。术后复发转移率随良性、交界性、恶性3种类型肿瘤病理学分级程度增加而增大，并随手术范围扩大而减小。PTB患者5年内总生存率为96.08%(147/153)，其中良性、交界性、恶性PTB患者生存率分别为100.00%(71/71)、96.88%(31/32)、90.00%(45/50)。

2.2 Piwil2、Stat3在恶性PTB组织、正常组织中表达情况 Piwil2蛋白在恶性PTB组织中的阳性表达率为均80.00%(40/50)，显著高于对照组的24.29%(17/70)，差异有统计学意义(P<0.05)。Stat3蛋白在恶性PTB组织中的阳性表达率为均78.00%(39/50)，显著高于对照组的20.00%(14/70)，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 Piwil2、Stat3在恶性PTB组织、正常组织中表达情况(a.Piwil2在正常组织中阴性表达；b.Piwil2在恶性PTB组织中阳性表达；c.Stat3在正常组织中阴性表达；d.Stat3在恶性叶状肿瘤组织中阳性表达)

2.3 Piwil2、Stat3表达在恶性PTB组织中的相关性 50例恶性PTB患者中，35例患者Piwil2蛋白、Stat3蛋白均表达为阳性，6例患者均表达为阴性，5例患者Piwil2阳性表达而Stat3阴性表达，4例患者Stat3阳性表达而Piwil2阴性表达。Piwil2、Stat3的表达在恶性PTB组织中存在正相关性(r=0.459，P<0.05)。

2.4 恶性PTB患者Piwil2、Stat3与临床病理特征关系 Piwil2、Stat3在恶性PTB组织的表达与淋巴结转移、同侧或对侧纤维腺瘤病史有相关性(P<0.05)，与年龄、肿瘤大小无相关性(P>0.05)。见表1。

表1 恶性PTB患者Piwil2、Stat3与临床病理特征关系/例(百分率/%)

3 讨论

恶性PTB是起源于小叶内或导管周围间质的一种极为少见的恶性肿瘤，病理特征常表现为叶状结构、核异性及分裂象、间质旁腺体增生现象严重，其发生机制尚不清楚[9-14]。虽然恶性PTB发病率较低，但具有较高的复发转移率，严重威胁患者的健康及生活质量。采用肿物单独切除术、肿物扩大切除术、乳房切除术3种术式均可治疗PTB患者[15]。本研究发现，良性PTB患者术后5年内未发生转移和死亡，交界性和恶性PTB均具有存在复发，并且恶性PTB同时具有较大的转移性；根据病情不同严重程度选择恰当的术式，以降低术后复发转移情况的发生。Piwil2在成人体细胞和干细胞中表达沉默，但在结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、胃肠道肿瘤等多种癌症中异常表达，不受肿瘤和组织类型的限制，而且与肿瘤的发生和预后不良相关[5-6，16]。有研究表明，Piwil2在肿瘤细胞中与核转录因子κB/p65共表达，二者协同促进肿瘤的发生，而定量检测其表达可用于预测肿瘤的发展情况[6]。有研究发现，Piwil2可通过表观遗传调控促进宫颈上皮细胞到肿瘤起始细胞的转化，在多种恶性肿瘤中高表达[17]。有研究发现，Piwil2在乳腺癌组织中阳性表达率显著高于癌旁组织，猜测Piwil2可能调控乳腺癌的发生发展机制[18]。

有研究表明，STATs作为细胞因子和生长因子信号的下游效应物在多种癌细胞系和原发性肿瘤中发挥作用[19]。Stat3可通过调控下游靶基因表达来促进细胞的增殖、抑制细胞凋亡，以此参与肿瘤的发生，且Stat3表达增加与卵巢癌淋巴结转移等因素相关[20]。本研究结果发现，Stat3蛋白在恶性PTB组织中的阳性表达率为均78.00%(39/50)，显著高于对照组的20.00%(14/70)，差异有统计学意义(P<0.05)。这提示，Stat3可能通过促进细胞增殖、抑制细胞凋亡，参与到恶性PTB的发生过程中。有研究显示，Piwil2表达上调与Stat3表达增加相关，其通过上调Stat3基因表达，促进细胞周期从G0/1到S期的转变以及核因子κB的表达，促进肿瘤的增殖以及抑制细胞凋亡[6]。Piwil2过表达可激活内源性RNA，增强Stat3/Bcl-xl、Stat3/CynlinD1信号通路，从而参与肿瘤的发生[7]。本研究结果还发现，Piwil2、Stat3的表达在恶性PTB组织中存在正相关性。这表明，Piwil2、Stat3可能通过协同作用共同促进肿瘤的发生。此外，Piwil2、Stat3在恶性PTB组织的表达与淋巴结转移、同侧或对侧纤维腺瘤病史有关，提示二者可能参与疾病进展。

综上所述，Piwil2、Stat3在恶性PTB组织中的阳性表达率显著增加，其阳性表达与淋巴结转移、同侧或对侧纤维腺瘤病史呈正相关性。Piwil2、Stat3可作为恶性PTB临床监测检测指标，用以检测患者临床症状特征，进行更有针对性的治疗。