小反刍兽疫病毒H蛋白的原核表达及免疫原性测定

李丹，宋浩志，高维崧，刘兴健，张志芳，李轶女

中国农业科学院生物技术研究所，北京100081

小反刍兽疫（peste des petits ruminants，PPR），俗称羊瘟，又称小反刍兽假性牛瘟，是由小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus，PPRV）引起的一种急性、烈性、接触性疾病[1]，其发病率和死亡率分别达到100%和90%[2]。该病于1940年首次发生于非洲象牙海岸，之后逐渐蔓延[3]。2003年以来，我国周边的缅甸、老挝、俄罗斯等国家相继爆发了严重的小反刍兽疫疫情[4]。2007年7月我国西藏自治区日土县热帮乡龙门卡村发生PPR疫情后，又相继发生了多起流行疫病[5]，且该病传播速度快、风险高，对我国动物疫情的防控造成极大的威胁[6]。我国已将其列为一类动物疾病，为最高关注级别。

目前，对于小反刍兽疫尚无有效的治疗方法，主要通过研制疫苗进行防控[7]。传统疫苗如弱毒疫苗、灭活疫苗，虽然可以有效预防疫病的发生，但是无法通过血清学检测区分疫苗免疫动物与自然感染动物[8]，难以在PPR流行地区进行有效的调查，且在保存、使用和接种等方面均易出现相关问题[9]。近年来，基因工程疫苗取得了巨大的进展，由于其具有安全、免疫效果可靠、易大量生产等特点，在预防小反刍兽疫疫情中发挥重要作用。但作为一种新型疫苗，基因工程疫苗仍有较多需要改进的地方[10]，如免疫效力有待提高及可能产生免疫耐受、插入突变等现象。近年来，PPR疫苗的研制仍是研究的热点。

小反刍兽疫病毒属于副黏病毒科、麻疹病毒属[11]，其基因组为单股负链RNA[12]，含有6个基因，依次为3′-N-P-M-F-H-L-5′，编码核衣壳蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝蛋白（H）和大蛋白（L）6个结构蛋白和C、V 2种非结构蛋白[13]。其中，PPRV的H基因全长1 852 bp，编码609个氨基酸，分子量约为70 kD[14]。PPRV H蛋白具有神经氨酸酶及血凝素活性[15]，其是病毒表面的主要抗原，与宿主细胞表面受体连接，可诱导机体产生中和抗体[16−17]。因此，H蛋白可作为抗原进行PPRV疫苗研究。本研究将H蛋白在原核表达系统中进行表达，并通过菌株筛选及表达条件进行优化提高H蛋白表达量，将该抗原制备为疫苗在小鼠中对其免疫效果进行评价，以期为H蛋白筛选出一种高表达条件，并对原核表达系统中表达的H蛋白免疫原性进行初步评价。

1 材料与方法

1.1 主要材料及试剂

SPF级实验小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；T4DNA连接酶、DNA聚合酶、重组酶购自北京诺维赞生物科技有限公司；质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒购自天根生化（北京）科技有限公司；限制性内切酶、Protein marker购自Thermo Scientific公司；鼠源PPRV H单克隆抗体购自英国皮比赖特研究所（Pirbright Institute）；HRP标记山羊抗小鼠IgG购自Beyotime公司；化学发光试剂盒购自碧云天生物技术公司；佐剂Montanide GEL 02 PR购自法国SEPPIC公 司；TOP10、BL21（DE3）、BL21（DE3）PLySs、Rosetta（DE3）感受态细胞、Vero细胞由实验室保存；PPRV疫苗株（PPRV 75/1 Clone9）购自天康生物技术公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）及DMEM培养基购自Gibco公司；ELISA及包涵体纯化所用试剂配方参照张伟业等[18]的方法。其余试剂均为国产分析纯；PPRV的H基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，引物合成及测序由北京睿博兴科生物科技有限公司完成。

1.2 原核表达载体的构建

1.2.1 目的基因的优化合成从GenBank数据库中查找目前公布的小反刍兽疫H蛋白的氨基酸序列，利用Mega[19]软件进行序列比对，筛选出1条符合我国流行趋势的氨基酸序列，对其进行跨膜区预测及信号肽分析。综合考虑密码子使用情况及临近密码子使用频率等其他负面约束，对PPRV的H基因序列进行优化，并在其5′端添加起始密码子及BamHⅠ酶切位点，3′端添加终止密码子及EcoRⅠ酶切位点，将该基因序列送至南京金斯瑞生物技术有限公司进行合成，合成的基因连接于pUC57载体上，并命名为pUC57-PPRV H。

1.2.2 原核表达载体的构建根据优化后的

pUC57-PPRV H基因设计引物进行PCR扩增，引物序列为PPRV H-F1:5′-CGGGATCCATGAGCGCGCAGCGTGAACGTATC-3′;PPRV H-R1:5′-CGGAATTCTTACACCGGGTTGCAGGTAACC-3′(下划线处分别表示BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点）。PCR程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，并利用胶回收试剂盒回收目的片段，利用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后在T4 DNA连接酶作用下连接于pET28a载体上，转化TOP10感受态细胞，在卡那抗性平板上筛选出阳性菌落，提取质粒，并用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切鉴定，鉴定正确的质粒送至北京睿博兴科生物科技有限公司测序。

1.3 重组蛋白的诱导表达

将重组质粒pET28a-PPRV H转化大肠杆菌BL21（DE3）、Rosetta（DE3）、BL21（PLySs）感受态细胞，在卡那抗性（50 mg·mL−1）平板中筛选阳性菌落，挑取单菌落于4.5 mL相同浓度卡那抗性的无菌LB培养基中，置于37℃摇床220 r·min−1培养2.5～3.5 h，加入不同浓度IPTG诱导6～8 h，同时，设置未加诱导剂作为对照。8 000 r·min−1离心10 min收集菌体，并加入450 μL PBS重悬，按照破碎3 s停5 s的原则进行超声破碎，12 000 r·min−1离心10 min，收集上清及沉淀，分别取10 μL上清及沉淀进行SDS-PAGE分析。

1.4 融合蛋白的亲和纯化

在200 mL培养基中大量表达PPRV H蛋白，离心收集菌体。加入20 mL裂解缓冲液置于冰上裂解30 min，然后进行超声破碎（功率为200 W）5次，每次间隔2 min，12 000 r·min−1离心10 min，收集沉淀，用20 mL包涵体洗涤液Ⅰ和包涵体洗涤液Ⅱ洗涤1次，弃多余液体，沉淀中加入20 mL脲NTA-0 Buffer缓冲液于4℃过夜溶解。12 000 r·min−1离心10 min，取上清用0.45 μm滤器过滤后装入镍柱，收集穿透液重复上柱2次，分别用咪唑浓度为50、100、250 mmol·L−1的NTA-尿素缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，进行SDS-PAGE检测纯化结果。

1.5 Western-blot分析及质谱鉴定

将表达的蛋白样品进行SDS-PAGE后，用湿转法转移至硝酸纤维素膜上，在3%的BSA中过夜封闭，将鼠源PPRV H单克隆抗体稀释1 000倍后孵育1.5 h，再将HRP标记山羊抗小鼠IgG稀释5 000倍孵育1.5 h，每次孵育前用PBST将多余液体清洗干净。最后在膜上滴加化学发光液后置于化学发光仪中显色。对鉴定正确的样品，切取SDS-PAGE中大小合适的蛋白胶条置于PBS缓冲液中，送至上海欧易生物公司，使用Easy-nLC 1 200液相系统、高pH分离液相色谱仪等进行质谱鉴定。

1.6 重组蛋白PPRV H免疫小鼠

将购买的Balb/c小鼠饲养至7周龄，取纯化的PPRV H蛋白样品20 μg与佐剂Montanide GEL 02 PR按照7∶1混合后腹腔多点注射小鼠，同时，设置PBS组作为阴性对照，每个样品设10个重复。从一免2周开始每周进行眼球后静脉取血，取得的血液室温静置2 h，2 000 r·min−1离心5 min分离血清。免疫3周后，以相同剂量进行二次免疫，每周取血清置于−80℃冰箱保存。

1.7 酶联免疫吸附实验（ELISA）检测血清抗体滴度

对纯化好的PPRV H蛋白用蛋白定量试剂盒进行浓度测定，用包被缓冲液稀释至5 μg·mL−1，每孔100 μL加入96孔板中，置于4℃冰箱过夜包被。每孔加入300 μL 3% BSA，置于37℃培养箱封闭1.5 h。将小鼠血清从200倍开始进行2倍倍比稀释后，每孔加入100 μL孵育1.5 h，同时将PBS组血清以相同倍数稀释作为阴性对照。以HRP标记的山羊抗小鼠IgG为二抗，每孔100 μL孵育1 h。每次抗体孵育前用PBST将多余液体清洗干净。加入OPD显色液于暗处显色30 min，加入50 μL 2 mol·L−1硫酸终止反应，在酶标仪中492 nm处测定吸光值。计算P/N值，样品组大于阴性对照2.1倍即为阳性。

1.8 中和抗体检测

将Vero细胞用含10%FBS及1‰青霉素链霉素（1∶1）的DMEM培养基稀释至105个·mL−1，每孔100 μL加入96孔板中培养约10 h，待细胞完全贴壁。将小鼠血清置于56℃水浴锅30 min使灭活补体，经0.22 μm滤膜过滤后，用无血清DMEM培养基进行2倍倍比稀释。将稀释后的血清与等体积的100倍半数组织细胞感染量（median tissue culture infective dose，100 TCID50）PPRV疫苗株混合，置于37℃培养箱孵育1 h。每孔200 μL加入培养好的Vero细胞中，每个样品设5个重复，同时设置空细胞对照组及病毒对照组。每天观察细胞发病状况，待病毒对照组全部发病时进行记录，能完全中和病毒的血清最大稀释倍数即为血清的中和抗体效价。

2 结果与分析

2.1 目的基因的优化合成

从GenBank数据库中获取小反刍兽疫H蛋白的氨基酸序列（GenBank:AJE30413.1），小反刍兽疫病毒H蛋白编码609个氨基酸，对其进行信号肽预测及跨膜区分析，结果显示，PPRV H蛋白无信号肽，其36～58位为跨膜区序列。去除跨膜区及胞内区序列，将其余氨基酸序列进行密码子优化，优化后基因长度为1 659 bp，通过密码子适用指数（codon adaptation index，CAI）及GC含量预测其表达水平，结果显示，H蛋白优化后序列的CAI达0.94，表明该基因序列的密码子使用情况较理想，GC含量为46.98%，在理想的GC含量范围内，预测该基因有较高的表达水平。将该序列送至南京金斯瑞生物技术有限公司进行合成。

2.2 原核表达载体的构建

设计引物通过PCR扩增出PPRV的H基因序列，经琼脂糖凝胶电泳，在1 600 bp附近出现清晰的目的条带，与预期大小一致（图1A），对其进行回收后利用双酶切法连入pET28a载体，在卡那抗性平板中筛选出阳性菌株，提质粒后用BamHⅠ与EcoRⅠ进行酶切鉴定，结果如图1B所示，在1 600 bp及5 300 bp附近分别出现目的基因及载体条带，与预期结果相符。将该质粒送至北京睿博兴科生物技术公司测序，测序结果与目的片段相符，表明原核表达载体pET28a-PPRV H构建成功。

图1 目的基因的PCR扩增及重组质粒的BamHⅠ、EcoRⅠ酶切鉴定Fig.1 PCR amplification of the target gene and BamHⅠand EcoRⅠdigestion identification of the recombinant plasmid

2.3 重组蛋白的诱导表达

将重组质粒转化BL21（DE3）、Rosetta（DE3）、BL21（DE3）PLySs感受态细胞，经表达条件优化后，筛选出表达量高的Rosetta（DE3）菌株在37℃、0.5 mmol·L−1IPTG诱导7 h进行表达。表达产物经SDS-PAGE检测，与未诱导组相比，IPTG诱导后在65 kD附近出现清晰条带，与预期大小相符。且该蛋白主要出现在沉淀中，表明外源蛋白主要以包涵体形式表达，可溶性表达较少（图2）。

图2 重组蛋白在Rosetta菌株中的诱导表达Fig.2 Induced expression of recombinant protein in Rosetta strains

2.4 重组蛋白的亲和层析纯化及浓度测定

在大量诱导表达的菌液中收集菌体，经超声破碎、离心、洗涤、溶解等步骤后，将包涵体样品用镍柱进行亲和层析纯化，纯化的样品经SDS-PAGE检测，在咪唑浓度为100及250 mmol·L−1的NTA-脲洗脱液中均有单一蛋白被洗脱下来，大小与目的蛋白相符（图3）。将纯化得到的单一蛋白样品混合后用BCA蛋白定量试剂盒进行浓度测定，结果显示，纯化得到的蛋白浓度为108 μg·mL−1。

图3 重组蛋白的镍柱亲和纯化Fig.3 Nickel column affinity purification of recombinant protein

2.5 Western blot分析及质谱鉴定

以PPRV H单克隆抗体作为一抗，HRP标记山羊抗鼠IgG为二抗对纯化的样品进行Western blot试验，在约65 kD附近出现清晰条带，大小与预期一致，而对照中无相应条带（图4），表明目的蛋白在大肠杆菌中表达，且表达量较高。进一步切取目的蛋白进行质谱鉴定，结果表明该蛋白为PPRV H蛋白。

图4 重组蛋白的Western blot分析Fig.4 Western blot analysis of recombinant protein

2.6 重组蛋白免疫小鼠后血清抗体效价检测

将20 μg纯化的PPRV H蛋白样品混合佐剂后以免疫小鼠，取血清后以0.5 μg H蛋白作为抗原进行ELISA效价检测。一免2周时，样品组吸光值明显高于对照组，表明小鼠产生了PPRV H蛋白抗体，抗体滴度为1∶100。随着时间延长抗体滴度逐渐升高，在两免2周时抗体滴度达到1∶6 400，表明H蛋白可诱导小鼠产生较强的免疫反应（图5）。

图5 重组蛋白免疫小鼠后引起的抗体效价检测Fig.5 Detection of antibody titer caused by recombinant protein immunization in mice

2.7 重组蛋白免疫小鼠后血清抗体效价检测

为测定血清对PPRV病毒的中和效价，进一步对两免2周时血清在Vero细胞上进行中和抗体检测。如图6所示，加入TCID50的病毒感染细胞时，细胞出现明显聚集、皱缩等病变现象；当加入的小鼠血清能完全抑制病毒扩增时，无病变现象出现；空细胞对照组无病变现象。结果显示，该血清对PPRV疫苗株具有明显的中和效应，根据Reed-Muench法计算后，其中和抗体效价不高于1∶40。

3 讨论

近年来，随着生命科学的发展，小反刍兽疫疫苗的研发取得了明显的进展，灭活疫苗、基因工程疫苗、重组疫苗相继问世，对控制小反刍兽疫疫情蔓延具有重要作用。但这些疫苗通常需辅助剂以提高免疫效果，仍需开发出可引起强烈的细胞免疫应答和体液免疫应答的疫苗，以有效控制该病在我国的蔓延，甚至消灭该病，因此，对小反刍兽疫疫苗的研制引起了人们广泛关注。PPRV H蛋白是病毒粒子上的重要糖蛋白之一，具有神经氨酸酶活性和血凝素活性，其主要作用是作为受体连接病毒和宿主细胞，调节病毒吸附及侵入，并能诱导机体产生中和抗体[7]，是机体主要的保护性免疫原。

Tian等[20]将H蛋白全长克隆至pET28a载体上，并在Rosetta菌株中进行表达，优化条件后其表达量仍较低，而选择将H蛋白的主要抗原位点分段进行表达，表达量明显提高，且能引起宿主的免疫反应，但抗原的完整性受到影响，进而可能影响后续试验。2006年，陈勇军等[21]发现，将猪繁殖与呼吸综合症病毒GP5蛋白的跨膜区去掉，在原核表达系统中可明显提高该蛋白的表达量，并证实去掉跨膜区的GP5蛋白仍能诱导良好的体液免疫和细胞免疫。因此，为高效表达具有免疫活性的H蛋白，可将H蛋白跨膜区及胞内区序列去掉，保留其所有胞外区序列进行表达。另外，丁军颖等[22]发现，菌株浓度不同时进行诱导表达，对丁肝抗原蛋白的表达具有重大影响。王劼等[23]发现，菌株浓度、IPTG用量及诱导时间对目的蛋白表达量均有显著影响。因此，合适的表达条件对提高外源蛋白的表达量具有重要意义。本研究对表达菌株及表达条件进行了优化，筛选出表达量高的菌株在合适的条件下表达H蛋白，为原核表达系统表达H蛋白提供了实验基础。

目前在大肠杆菌中表达PPRV H蛋白主要用于制备抗体[24]，本研究利用大肠杆菌Rosetta（DE3）菌株高效表达仅去除跨膜区的H蛋白，并对表达蛋白在小鼠中的免疫效果进行了评价，发现该蛋白在小鼠中引起了较强的免疫反应，血清抗体滴度在两免2周时达到1∶6 400，并产生了PPRV病毒的中和抗体，表明大肠杆菌表达的H蛋白具有良好的免疫原性及反应原性，能诱导小鼠产生保护性中和抗体，说明原核表达的H蛋白作为PPRV亚单位疫苗的研究应用前景良好。