薯蓣皂苷对博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化的保护作用研究

尹连红 许丽娜 彭金咏

特发性肺间质纤维化(Idiopathic Pulmonary fibrosis, IPF)是一种呈进展性和致死性的弥漫性肺间质疾病，早期以肺泡炎症为特征，后期发展至大量成纤维细胞异常增殖和细胞外基质大量沉积[1-2]。博莱霉素(Bleomycin, BLM)是一种广谱抗肿瘤药物，在使用后期会导致肺纤维化症状，被广泛用于肺纤维化模型的相关研究。薯蓣皂苷(Dioscin, Dio, 图1)广泛存在于薯蓣科、石竹科、蔷薇科和百合科等植物中，属于三萜皂苷类化合物。薯蓣皂苷具有多种药理学活性，如抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗感染、降血脂及肝保护作用等[3]，其通过抗氧化应激和抗炎等作用保护急性肝损伤及肝纤维化[4-6]。本研究在BLM诱导的大鼠肺纤维化模型中探讨薯蓣皂苷对肺纤维化的影响，并对其作用机制进行初步探讨，为肺纤维化的治疗提供新的契机。

图1 薯蓣皂苷化学结构式

资料与方法

一、动物与材料

雄性SD大鼠，体重180～220 g，由大连医科大学SPF实验动物中心提供，合格证号：SCXK(辽)2015-0006，室温22 ± 2℃，湿度55%-70%，自由摄食与饮水。

薯蓣皂苷为本实验室制备，纯度≥98%(与标准品对照)，结构经UV、MS和NMR鉴定[7](图1)；强的松购自Sigma Chemical Co；蛋白提取试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；总抗氧化能力(T-AOC)、羟脯氨酸(HYP)检测试剂盒，均购自南京建成生物技术公司；BCA蛋白浓度测定和BeyoECL Plus试剂盒均购自碧云天生物技术研究所；甘氨酸、Tris、SDS等购自美国Sigma Chemical Co.；一抗兔源Foxo3a、ICAM-1、P65、TGF-β1、GAPDH、兔源二抗购自武汉三鹰生物技术有限公司。

二、实验动物分组处理

72只成年雄性SD大鼠(200～220 g)随机分为6组：生理盐水对照组(Control)，BLM组(Model)，薯蓣皂苷给药组(Dio 15、30和60 mg/kg)，强的松阳性对照组(PND 50 mg/kg)。BLM组经气管单次给予BLM (3 mg/kg)，薯蓣皂苷给药组和强的松阳性对照组：在BLM处理前7天及处理后30天每24 h灌胃给药一次，对照组给予等量生理盐水。用苏木精-伊红(H&E)染色，Masson染色，天狼猩红(Sirius Red)染色检测肺病理改变。各组动物分别于BLM处理后30天停止给药。于末次给药后，大鼠禁食不禁水24 h，眼后静脉丛取全血经离心得血清。处死大鼠，取出肺组织，测定肺系数，部分肺组织置于10%甲醛溶液中固定，用于组织病理学研究。

三、肺系数及生化指标检测

肺系数是肺纤维化的一项测量指标，称定大鼠体重和肺湿重，计算肺系数。肺系数=肺湿重(g)/体重(kg) × 100%。

根据说明书测定血清的总抗氧能力T-AOC，用于评价肺组织损伤程度。

四、肺组织羟脯氨酸(HPY)含量测定

将肺组织匀浆离心后取上清，按HYP试剂盒中的酸水解法说明书，测定每组大鼠肺组织中HYP的含量。

五、Western blot

取肺组织按照试剂盒说明书进行操作，加入裂解液，充分匀浆，然后10000 rpm，4℃离心10 min，收集上清，采用BCA法测定蛋白浓度。组织蛋白与2 × loading buffer (100 μL + 4 μL β-巯基乙醇)按1: 1 (v/v)混匀，煮沸5 min，-80℃分装保存备用。根据目标蛋白分子量配制适当比例的SDS-PAGE进行电泳；根据目标蛋白的分子量，湿转转膜；将载有目标蛋白的PVDF膜放入5%脱脂奶粉中，摇床上室温封闭3 h。将封闭好的膜用TTBS洗5 min，放入相应比例的一抗中，4℃孵育过夜。TTBS洗膜3次，每次10 min，放入对应的二抗中，摇床上室温孵育2 h，TTBS洗膜三次，每次10 min。化学发光显影，并采用Lab Works 4.6专业图像分析软件进行图像分析。

六、统计学分析

结 果

一、大鼠肺系数、T-AOC和HYP的含量

肺系数是反映肺纤维化程度的一个重要指标，如由(图2A)所示，与Control相比，Model组的肺系数明显升高，由3.99±0.63上升至5.83±1.16 (P=0.005)；与Model组比较，薯蓣皂苷给药组(Dio 60 mg/kg，Dio 30 mg/kg)大鼠肺系数明显降低，Dio 60 mg/kg组可降低至3.59±0.40，差异具有统计学意义(P<0.05)。如由(图2B)所示，与Control相比，Model组的总抗氧能力显著升高，由3.23±0.69上升至43.44±12.42 (P=0.0023)；与Model组相比，薯蓣皂苷给药组显著降低(P<0.01)，Dio 60 mg/kg组可降低至6.02±0.59。如(图2C)所示，与Control相比，Model组的HYP的表达量明显增加(P<0.05)；与Model组相比，14天时薯蓣皂苷给药组中大鼠肺组织HYP的含量无显著变化，28天时薯蓣皂苷给药组大鼠肺组织HYP的含量明显减少(P<0.05)，且Dio 30 mg/kg组的治疗效果与PDN 50 mg/kg组相当。

二、肺组织病理结果

正常大鼠肺组织结构清晰，肺泡壁正常，偶见炎症细胞，无间质纤维化增生；BLM造模7天结果表明大鼠肺组织病变早期表现为渗出性肺泡炎，炎症细胞在病变处聚集增多。BLM造模14天时，与Control组相比，BLM组HYP含量明显升高，由0.57±0.14上升至0.83±0.25(图2C)。显微镜下可见广泛炎症细胞浸润，以淋巴细胞、单核吞噬细胞为主，并有肺泡壁增厚、成纤维细胞增生等Ⅱ级肺泡炎表现。第28天可见肺间质内有大量散在的胶原纤维，肺泡隔增宽明显，肺泡结构破坏，有许多成纤维细胞等肺间质纤维化病变，即造模晚期为肺间质纤维化，纤维结缔组织增生明显，基质胶原聚集，取代了正常的肺组织结构。随着时间的变化，肺组织的的炎症反应程度，纤维化程度及量化结果(如图3)所示。随着造模时间的延长，肺纤维化的程度逐渐增加，Masson染色结果中第14天的相对纤维化为6.03±0.85，第28天的相对纤维化为12.77±1.24。Sirius Red染色结果中第14天的相对纤维化为4.91±1.02，第28天的相对纤维化为7.41±1.08。

图2 薯蓣皂苷对BLM诱导的肺纤维化大鼠的肺系数、 T-AOC和HYP的影响

图3 BLM诱导大鼠肺组织纤维化的病理学染色结果 (200 ×，n=3) 1. 肺泡间隔增宽；2. 纤维(蓝色)；3. 肺泡结构破坏；4. 纤维(红色)

薯蓣皂苷处理组(Dio 60、30和15 mg/kg)小鼠的以上症状得到明显改善，肺组织的H&E，Masson和Sirius red染色(如图4)所示。口服薯蓣皂苷后，大鼠肺组织中胶原明显减少(P<0.05)，纤维化程度降低，肺泡结构有所恢复，且成剂量依赖性。60 mg/kg组的Masson染色的相对纤维量由Model组的9.53±1.41降低至3.29±0.28。60 mg/kg组的Sirius red染色的相对纤维量由Model组的5.81±0.78降低至1.44±0.26。以上结果表明薯蓣皂苷可以有效改善BLM诱导的肺组织病理学变化，减少纤维化的发生。

图4 薯蓣皂苷对大鼠肺组织病理学染色(H&E、Masson和Sirius Red)的结果(200×)

三、 各组大鼠肺组织关键蛋白的表达

大鼠肺组织Western blot检测结果(如图5)所示，与BLM模型组相比，Dio15 mg/kg, 30 mg/kg和60 mg/kg给药组中，TGF-β1，Foxo3a，ICAM-1，P65蛋白的表达显著降低(P<0.05或P<0.01)，具有统计学意义。因此，薯蓣皂苷能明显下调肺纤维化大鼠肺组织中炎症反应。结果表明，薯蓣皂苷体内抑制肺纤维化的发生、发展与TGF-β1/Foxo3a信号通路相关。

图5 薯蓣皂苷对肺纤维化大鼠肺组织中TGF-β1，Foxo3a，ICAM-1，P65蛋白的表达

讨 论

IPF是一种进行性异质性肺病，患病后肺呼吸功能严重受损，治愈率较低，最终患者会因呼吸衰竭而死亡。临床上用于治疗该疾病的药物包括尼达尼布、吡非尼酮、免疫抑制剂和皮质类固醇激素等西药，还包括藏红花、黄芪、丹参和五味子等中药，但药物的选择仍有限，治疗效果仍不理想。因此，探寻肺纤维化的有效治疗药物成为当下医学研究的热点和难点。BLM诱导的肺纤维化动物模型模拟了IPF的临床病理特征，常被用于IPF治疗药物的药效学和分子机制研究。在本研究中，我们建立了BLM诱导的大鼠肺纤维化模型来评价薯蓣皂苷的抗肺纤维化活性，而肺系数、T-AOC、HYP以及病理学染色结果均表明，薯蓣皂苷对BLM诱导的肺纤维化具有显著的保护作用。

IPF的病理机制仍不明确，但其发生和发展与许多细胞因子、炎症介质有关，这些细胞因子和炎症介质之间相互作用，相互协调，形成一个复杂而多变的分子网络，在肺纤维化形成中起着重要的作用[8]。TGF-β1在肺纤维化发病过程中，起着中枢调控的重要作用，是作用最强的致纤维化因子，而且参与调控发病机制非常明确，TGF-β1能诱导大量成纤维细胞增殖分化为肌成纤维细胞，而肌成纤维细胞对细胞凋亡有抵抗作用，并在成纤维细胞病灶的活动性纤维化部位聚集，最终导致细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)的过多产生和沉积[9-11]。BLM可以诱导肺纤维化发生，导致TGF-β1升高，促进肺部炎症反应，增加炎性细胞的数量，而薯蓣皂苷则可以显著减少TGF-β1的表达，缓解肺部炎症，抑制肺纤维化的发生。

近年研究表明，FOX (forkhead box protein)家族是调控上皮细胞间质转分化的重要转录因子[12]，其中Foxo3a (forkheadbox protein O3a)是参与纤维化的发生发展的重要成员[13]。Foxo3a在TGF-β诱导的肾上腺皮质转分化中具有重要作用，另有研究发现Foxo3a参与了肺纤维化上皮间质转分化的过程，是特发性纤维化治疗的重要靶点，参与体内凋亡、氧化应激等多种病理生理过程的调节[14-15]。本研究结果发现，BLM可以促进Foxo3a表达，而薯蓣皂苷可以显著降低Foxo3a的表达。此外，Foxo3a可以激活NF-kB，调控多种炎症因子的基因转录[16]。NF-κB在炎症反应调控中起核心作用，P65是其重要的功能亚单位，NF-κB的过度活化，会导致细胞因子、趋化因子基因表达增高，导致肺纤维化[17-18]。P65表达的增加可以诱导ICAM-1[19]，ICAM-1在炎性细胞及肺泡上皮的表达增加，提示其参与肺纤维化的肺组织的炎症与修复过程[20-22]。薯蓣皂苷可以减少BLM导致大鼠肺组织中的Foxo3a及其下游P65和ICAM-1的表达，即薯蓣皂苷通过调控炎症反应抑制肺成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化以遏制纤维化发展。因此，我们认为薯蓣皂苷主要是通过抑制TGF-β1的表达进而调控Foxo3a的表达减轻肺纤维化上皮间质分化，调控炎症反应而发挥对肺纤维化保护作用。

本文研究结果表明薯蓣皂苷可以显著减轻BLM诱导的肺组织结构破坏及间质纤维化，对BLM诱导的大鼠肺纤维化具有显著保护作用，该作用可能是通过调控TGF-β1/Foxo3a信号通路实现的。