活体浮游植物色素分析在湖库生态监测中的应用

陈永玲

（山东省烟台生态环境监测中心，山东 烟台 264000）

所谓富营养化，是指湖沼、蓄水池、河川过度吸收氮、磷等营养盐，使水域的生态结构和功能发生变化，导致藻类、特别是蓝藻类的异常增殖现象。许多藻类死后在其分解过程中，不仅发出恶臭，甚至导致鱼类的死亡，破坏了自然环境。而且，藻类对水生生物有很大的威胁，可以释放出威胁饮用水安全和人类健康的生物毒素。作为饮用水和工业用水的供给源，水的富营养化影响了水质的质量，增加了水生产的成本，对社会环境和经济产生了很大的影响。

近年来，用于检测植物浮游生物色素的荧光分析技术，逐渐应用于湖沼调查中。作为植物浮游生物机体分类的指标，主要的藻类色素是叶绿素a，叶绿素b，叶绿素c，花青素，纤维叶绿素，胡萝卜素。叶绿素a存在于藻类中，作为藻类生物物质指标的叶绿素b，及在绿藻类和百合目植物中发现的花青素和叶绿素存在于蓝藻类和红藻类中。红藻主要生活在海水中，花青素可以作为淡水蓝藻类的生物量指标来使用。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

M53（B）荧光光谱仪、Flow成像器（Skalar、荷兰）、显微镜、Axio成像器A1（ZISS、德国）、DR/40U光谱仪（HAH、USA）、真空泵（GAST、英国）、三重吸滤器（Sydolis、德国）、表型慢离心分离器（TDSA WS、Leiber离心分离机，北京）、串珠磨削组织磨床（MB-8，biospec，美国）、纤维素醋酸膜（光栅0.45 m，北京石灰膜分离技术有限公司），植物浮游生物计数框（武汉水生研究所）。

1.2 供试样品

采样地点：主要饮用水源、工业水源水库、主要饮用水源湖和烟台主要风景湖。采样时间：2009年4月、7月、9月、2009年5月、7月、2010年9月、2011年5月、7月、2012年9月、5月和2013年8月。

1.3 样品采集

根据每个水体的实际情况，使用有机玻璃取样器混合样品。在每个样品中采集3～4升的混合样品。湖沼样品300 ml，贮 水池样品500 ml，植物浮游生物定量样品。剩余的水样用于生活色素分析。取完水样后，在低温暗处保存，于6～8小时内进行预处理。

1.4 水样前处理

测试叶绿素a的水样前处理步骤：在抽滤器上装好乙酸纤维滤膜，倒入定量体积的水样进行抽滤，抽滤时负压不能过大（约为50 kPa），否则会破坏藻类细胞组织。水样抽干后，继续抽滤1～2分钟，以减少滤膜上的水分。将抽滤后的滤膜放入垫好滤纸的平皿中，置于冰箱冷藏室，低温干燥6～8小时。

植物浮游生物定量分析的预处理步骤：取1升水样到分离漏斗中，加入15 ml的溶液固定，可耐受24小时以上。

1.5 实验方法

叶绿素a含量分析：在7 ml的塑料离心管中加入5 ml 90%的丙酮溶液，放入2 ml的玻璃珠，将干燥的过滤膜放入离心管中并浸入丙酮中，不含气泡。放入砂轮的固定孔中，拧紧固定螺母，启动3～5 m的振动磨床。之后放入冰箱，低温避光6～24 h后，完全提取了叶绿素a。

离心分离后15分钟，取出离心分离器的离心分离管，将上清液转移到体积烧瓶，将体积固定在10 ml。将提取的溶液放入分光光度计中，分别读取663 nm、645 nm、630 nm、750 nm波长的吸光度值，并将90%的丙酮用作空白以校正吸收率。

2 结果与讨论

2.1 水库样品测试结果

在蓄水池的试验样品中，分别在夏季和秋季两个主要饮用水源蓄水池中检测出了花椒氨酸。花青素的检测率小于10%。春季硅藻优占，夏天硅藻类和绿藻类优占。这些水库的个体群结构良好，蓝藻水华的概率非常低。

烟台的门楼水库就是饮用水源地，5年中，春季仅有一次检出藻蓝素，春季藻蓝素检出率为20%，春季浮游植物以硅藻和绿藻为优势，个别年份春季蓝藻门所占比率比较高。夏、秋季节藻蓝素检出率为88%，仅有一次未检出藻蓝素。夏、秋季浮游植物以蓝藻门的微囊藻、鱼腥藻为优势种。各季节藻蓝素总检出率为54%，2009年9月出现水华，蓝藻细胞数量占浮游植物细胞总数量的91.3%，藻蓝素测试值高达1 750 ug/L，2012年8月藻蓝素测试值也高达359 ug/L，蓝藻细胞数量占浮游植物细胞总数量的94.8%，水体富营养化，仅用作景观补水和工业用水。

2.2 湖泊样品分析结果

在6个湖泊样品中，藻蓝素是2009年9月和2011年9月检测出的，藻蓝素的检测率为15%。春天硅藻类和绿藻类是优占植物浮游生物，夏天和秋天，植物浮游生物群集结构是硅藻、绿藻和蓝藻类。水质营养状态良好，应努力保护，以确保饮用水功能。

在五个湖中的四个，春季藻蓝素检测出少量样品，春季藻蓝素检测率为10%。在花青素中大部分检测到夏季和秋季的样品，夏季和秋季的花青素检测率为72%。在这些湖泊中，植物浮游生物的个体群结构在春季为硅藻＋硅藻类，硅藻＋绿藻，夏天是绿藻＋蓝藻类，秋天是蓝藻类。这些湖沼中的花青素检出率每季节为48%，烟台的湖沼中，夏季和秋季蓝藻类会大量繁殖，有可能引起蓝藻污染。

随着近年来对环境保护所做出的努力，四个湖沼中的两个开始通过大规模曝气和海蓝养殖等措施，水质的富营养化逐年减少。秋季植物浮游生物群集结构变为蓝藻类+蓝藻型，湖中的花青素检测率减少到23%。样品的检测率仅为92%。春季，植物浮游生物个体群结构是绿藻+蓝藻类，夏季和秋季植物浮游生物个体群结构是蓝藻类。这个湖被选择用来比较近五年每个季节的植物浮游生物，及西兰花细胞和花青素的数量，并且显示了用经典方法测量的花青素值和绿素a含量之间的对应关系[1]。

2.3 水污染浮游植物监测

生态系统和群集水平的生物标志通过生物多样性效应可以显示水质污浊物质对环境的影响，实现水质污浊的生物学监测。对水质的变化和社区的生态学影响主要通过出现或消失的指标（主要是对特定污染物质敏感或抗药的物种）来明确植物浮游生物种类或群体的数量及结构变化，结构变化独立营养从属营养程度的变化生产性水平的变化。

2.4 水污染浮游植物监测存在的问题

国内外科学家对水质污浊的生物学监测进行了详细的研究，对研究结果进行了定量、定性分析。这些研究不仅为水质污染的生物学监测提供了丰富的数据，还为水质污染的生物学监测实践提供了可靠的理论基础，为研究人员提供特定的研究想法和理论指导。但是，在水质污染的生物学监测研究中，有很多不能忽视的问题（1）生物标记在水质污染的生物学监测中起着重要的作用，但是有很多缺点。第一，生物标志的决定既困难又昂贵。第二，有些生物标志不够。第三，一些生物标志在实际环境中并不十分敏感。第四，由于在水质的生物学监测过程中选择了生物，所以同一有机体对污染物的灵敏度和响应在不同的生长时期表现不同，即使同一生物在同一时期也存在个体差异。因此，在监测和评估水质污浊的过程中，生物标志不是全能的。（2）选择的生物标志应是综合监测系统的有效部分。生物标志存在于天然的水环境中，不仅受水环境中的污染物影响，还受气候、季节、地区等诸多因素的影响。因此，只要建立标准化的监测方法并比较结果，该方法就具有应用的价值。水生动物的群集结构和相对量反映了水质污浊的情况，而公式计算出的污染程度数值更好地反映了实际情况，易于比较数据，社区结构和功能本身复杂，影响因素多，而且公害只有其中一个。通过对环境因素的综合考虑，我们发现了生物群集结构定量变化的本质原因。这与田间复杂的水生生态环境不同。应该尽可能地与研究所结合进行现场调查。确保实验的真实性，应用大量监测数据进行比对说明，测定不同条件下的各种数据[2]。

3 结论

经典的叶绿素a含量测试是2～3天，用显微镜分类植物浮游生物需要时间。由于叶绿体被蓝藻类的生物细胞纤维蛋白覆盖，所以测定的绿素a含量在蓝藻类覆盖下有很大的偏差。然而，通过荧光分析技术测量的花青素值与通过经典方法的测量值，以及通过显微镜计数的植物浮游生物数之间有显著的关联，可以定量地提供藻类布鲁姆形成的初始预警信号。它的应用价值是可以早期预警和监测饮水源。很多种类的蓝藻类含有微系统，使用荧光分析与微系统测试相结合，可以提供强大的数据支持来评估饮用水的安全性。