缺氧肿瘤光动力治疗的研究进展

张毓 苏丹柯

作者单位：530021 南宁 广西医科大学附属肿瘤医院放射科

光动力疗法（photodynamic therapy，PDT）是一种具有创伤性小、靶向性好、适用性广泛、可重复治疗等优点的肿瘤治疗新技术，原理是将光敏剂（photosensitizer，PS）特异性地聚集在肿瘤组织中并利用适当波长的光激发PS，被激活的PS再将能量转移到周围的氧分子（O2）［1-2］，导致氧气发生不完全还原反应而产生细胞毒性的活性氧（reactive oxygen species，ROS），如单线态氧（1O2）、过氧化物（O22-）、超氧化物（O2-）、羟基自由基（·OH）等，从而诱导细胞凋亡或坏死［3］。因此，PDT的疗效高度依赖于肿瘤组织中的氧含量，但肿瘤组织常因细胞快速生长和血液供应不足形成肿瘤缺氧微环境，PDT疗效因此明显受限［4］。PDT过程中快速耗氧也会加剧肿瘤组织缺氧，进一步阻碍PDT疗效［5］。近年来越来越多研究对肿瘤缺氧微环境下如何增强PDT疗效进行探索，本文就此作一综述。

1 改善肿瘤缺氧微环境

1.1 利用氧气载体输送氧气

1.1.1 血红蛋白载体 血红蛋白（hemoglobin，Hb）分子由4个血红素基团组成，是常用的氧气载体之一［6］。CAO等［7］设计了一种多功能纳米复合物（BP@RB-HB），其负载了传统PS玫瑰红（rose bengal，RB）、荧光共振能量载体Bp及供氧载体Hb。乳腺癌细胞MCF-7荷瘤小鼠静脉注射BP@RB和BP@RB-HB纳米复合物后肿瘤体积明显减小，证实负载有Hb分子的纳米复合物PDT抗肿瘤效果增强。GUO等［8］报道了一种负载Hb和PS吲哚菁绿（indocyanine green，ICG）的氧传递光敏脂质体（LIH），体外研究发现LIH可在缺氧条件下进入结肠癌细胞CT-26中并将氧气输送到细胞内。在近红外光照射下，LIH可产生大量1O2，从而提高CT-26细胞光毒性。因此，Hb分子可作为氧气载体将氧气输送到肿瘤组织中，改善肿瘤组织缺氧状态，增强PDT疗效。

1.1.2 红细胞载体 Hb分子具有携氧能力，但由于半衰期短、稳定性差，游离的Hb并不是向肿瘤组织输送氧气的最好选择［9］。红细胞（red blood cell，RBC）不仅含有Hb分子，还是人体的内源性成分，具有良好的生物相容性。因此，RBC可作为PS载体将氧气输送至肿瘤组织。WANG等［10］开发了一种可用于向肿瘤缺氧组织输送氧气的可控制RBC微载体，该载体包括特异性缺氧探针（hypoxia probe，HP）、功能化的正交激发上转换纳米粒子（upconversion nanoparticles，UCNPs）和PS玫瑰红。在缺氧条件下，胶质母细胞瘤细胞U87MG的RBC微载体中非活性HP转变为活性状态，从而激发Hb分子释放氧气，提高PDT疗效。U87MG荷瘤小鼠静脉注射RBC微载体后，较注射Si微载体小鼠肿瘤体积明显减少，显示了更高的抗肿瘤效果。TANG等［11］也介绍了一种利用RBC作为PS酞菁（ZnF16Pc）载体的RBC辅助PDT新技术（RBCPDT）。由于RBC具有携氧能力，因此即使在缺氧条件下，RBC-PDT系统也能有效地产生1O2，用胶质母细胞瘤细胞U87MG建立荷瘤小鼠模型后静脉注射RBC-PDT纳米复合物，显示了明显的肿瘤抑制作用。总之，RBC作为最常见的血细胞类型，可将纳米技术引入RBC中形成氧气载体，有效补充PDT过程中的缺氧。

1.1.3 全氟化碳载体 氧气在全氟化碳（perfluorocarbon，PFC）中具有极高的溶解度，大约为50.0 mL O2/100 mL，而氧气在血液中的溶解度仅为12.5 mL O2/100 mL。同时PFC是合成的有机分子，具有化学稳定性好、表面张力小、兼具疏油和疏水、无毒副作用等独特性，因此PFC 可成为替代 RBC 的氧气载体［12-13］。HU 等［14］将PS竹红菌乙素与PFC结合组装成含氟化物的胶束，且结合物的载氧能力与PFC含量呈正相关；PFC结合物对人肺癌细胞H1299的光毒性与结合物的用量相关，PFC结合物用量越大，对H1299细胞的光毒性效率越高。由此可见，PFC可作为氧气载体，但不能仅通过氧气浓度控制的单纯扩散方式释放氧气。因此，SONG等［15］在使用PFC纳米粒子作为氧气载体的同时利用超声特异性地调节肿瘤的缺氧微环境。综上，由于PFC良好的生物特性，且可通过呼气或皮肤毛孔排出，因此将PFC载体与PDT结合，可实现肿瘤组织连续供氧，增强PDT疗效。

1.2 肿瘤组织内部直接产生氧气

1.2.1 H2O2的分解 过氧化氢酶可以催化H2O2分解为H2O和O2。而肿瘤细胞由于异常的增殖速度、血管浸润、转移等特点而较正常细胞含有更多的H2O2［16］。因此，许多研究集中于将过氧化氢酶和PS共同传递至肿瘤组织，直接在肿瘤组织内部产生O2而增强PDT疗效。PHUA等［17］开发了过氧化氢酶包裹的透明质酸（hyaluronic acid，HA）纳米颗粒，并负载PS二氢卟吩 e6（Ce6）得到 HA-CAT@aCe6纳米系统，且在缺氧条件下培养乳腺癌细胞MDA-MB-231，结果HA-CAT@aCe6纳米系统中的过氧化氢酶可原位分解H2O2产生O2，从而缓解肿瘤组织缺氧，表现出较高的细胞毒性；MDA-MB-231荷瘤小鼠静脉注射HA-CAT@aCe6后肿瘤体积也明显减小。因此认为，HA-CAT@aCe6纳米系统可改善肿瘤组织缺氧并提高PDT疗效。除过氧化氢酶外，还有MnO2纳米粒子、金纳米簇合物、铂纳米酶等纳米材料［18-19］。YANG 等［20］将光敏剂（BSA-Ce6）和天然葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，Gox）复合到MnO2纳米粒子表面，再在其表面包裹红细胞膜形成仿生纳米复合物RMGB。体外实验表明，在缺氧条件下，RMGB复合物可诱导32.3%的小鼠乳腺癌4T1细胞凋亡。对4T1荷瘤小鼠静脉注射RMGB并进行激光照射后发现肿瘤生长明显受抑制，肿瘤重量也明显减轻。综上，不管是过氧化氢酶还是具有过氧化氢酶作用的纳米材料都可以在肿瘤组织内部直接催化H2O2产生O2，补充肿瘤组织的O2，增强PDT疗效。

1.2.2 水的分解 目前也有研究采用水的裂解作为氧气来源增强光动力疗效。LI等［21］将含铁碳氮化物（Fe-C3N4）纳米粒子与钌（Ⅱ）配合物结合，增强光的催化活性。在双光子激光照射下，钌（Ⅱ）配合物被激活成1O2，同时触发Fe-C3N4裂解水产生O2。在体外4T1细胞中观察到了明显的细胞光毒性作用，静脉注射纳米复合物并进行近红外照射后发现4T1荷瘤小鼠表现出明显的肿瘤抑制作用。因为人体内有充足的水可用于产生O2，因此水裂解也成为一种内源性的、可靠的、高效的产氧方法，并可有效改善PDT过程中的缺氧。

1.3 改善肿瘤微环境

1.3.1 通过升温改善肿瘤组织血流量 肿瘤组织缺氧的主要原因是肿瘤组织微血管改变和血液供应不足导致，因此增加肿瘤组织的血流量已成为提高肿瘤组织中氧浓度的有效措施。HU等［22］通过构建“温水浴（43℃）”改善人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）纳米颗粒PDT过程中肿瘤组织的血流量，并在纳米颗粒表面负载光敏剂（Ce6）。对4T1荷瘤小鼠静脉注射HSA纳米颗粒并接受“温水浴（43℃）”后发现当肿瘤组织温度从37℃上升到43℃时，肿瘤血流速度相应地从17.3 cm/s加速到32.4 cm/s，氧饱和度提高52%，进而提高PDT疗效。

1.3.2 通过降解细胞外基质重塑肿瘤微环境 肿瘤相关蛋白酶可能破坏正常结缔组织中的胶原蛋白、糖蛋白、弹性蛋白等蛋白质，减少肿瘤侵袭。研究发现透明质酸酶（HAase）能降解肿瘤细胞外基质（ECM）中的主要成分透明质酸（HA），从而改善肿瘤组织的血管紊乱，增加肿瘤灌注量。GONG等［23］在对4T1荷瘤小鼠静脉注射含光敏剂（Ce6）纳米复合物前，将HAase静脉注射到实体肿瘤中，通过产生的“增强渗透性和滞留性”（EPR）效应使纳米复合物的摄取量增加了2倍。在4T1荷瘤小鼠体内进行PDT研究，发现HAase处理后进行PDT可几乎完全抑制肿瘤生长。同样地，LIU等［24］也报道了一种增强PDT疗效的方法，对4T1荷瘤小鼠静脉注射含有胶原酶（collagenase，CLG）的CLG@NCP-PEG纳米颗粒复合物，发现CLG可以特异性地降解ECM中的胶原蛋白，增强肿瘤组织血流灌注量，缓解缺氧；然后对小鼠静脉注射含有Ce6的脂质体纳米复合物，在肿瘤组织缺氧缓解基础上有效增强了脂质体纳米复合物对小鼠的PDT疗效。综上所述，无论是通过升温改善肿瘤组织血流量还是通过降解ECM重塑肿瘤微环境，都可明显提高肿瘤组织中的氧含量，是增强PDT抗肿瘤作用的有效方法。

2 新型PDT模式

2.1 间歇式PDT疗法

减少氧气依赖的新型PDT模式越来越受到关注。据报道，间歇性地用光照射处理肿瘤组织可获得更好的PDT疗效。KLIMENKO等［25］对人慢性髓系白血病细胞K562分别进行连续照射和间歇式照射，发现间歇式PDT在产生1O2和肿瘤细胞复氧方面都显示出更高的效率。间歇式PDT细胞死亡机制为细胞凋亡机制，而连续性照射为细胞坏死机制。为进一步提高间歇式PDT疗效，TURAN等［26］研发了一种用于间歇式PDT的PS。该PS基于吡啶酮（PYR）产生，在光照期，PYR可与1O2反应转化为2-吡啶酮内过氧化物（EPO）；在间歇期，EPO又可通过热转换释放1O2，同时还原成PYR。因此，在光照期和间歇期，该PS均可产生1O2。分别评价PYR和EPO在人宫颈癌细胞HeLa中的PDT效率，发现两种化合物的细胞存活率均明显降低，且EPO具有更好的细胞毒性作用。因此认为，间歇式PDT因耗氧率减少可有效改善肿瘤组织缺氧，从而表现出更高的PDT疗效。

2.2 Ⅰ型PDT疗法

目前大多数与PDT相关的临床应用均基于Ⅱ型机制的PDT，即通过PS将能量传递给周围氧气生成1O2，而Ⅰ型机制是PS通过电子或质子的转移形成反应自由基（如·OH），从而破坏生物分子。可见Ⅰ型PDT的过程不依赖氧气，使之成为克服Ⅱ型PDT中缺氧限制的新方法。LV等［27］研发了香豆素修饰的环金属钌复合体（RU2）作为Ⅰ型PS，对HeLa细胞进行可见光照射，发现缺氧条件下RU2处理后细胞凋亡率为54%；而以RU2为PS的PDT治疗HeLa荷瘤小鼠，14 d后肿瘤重量从2.0 g降至0.1 g以下，说明即使在缺氧条件下，Ⅰ型机制为主的PDT也能表现出较高的肿瘤抑制作用。TIAN等［28］也提出一种氯甲基修饰Ru（Ⅱ）配合物作为PS的PDT纳米系统。Ru（Ⅱ）配合物在可见光的照射下产生自由基，在缺氧条件下也能诱导DNA损伤，导致细胞凋亡；且即使在低氧条件下，该纳米体系也能诱导21.1%的人卵巢癌细胞SKOV-3发生凋亡。综上认为，以Ⅰ型机制为主的PDT因其产生自由基过程中不需要氧气，因此在低氧条件下也能发挥作用，从而增强PDT疗效。

2.3 非氧气依赖型的细胞毒性化合物

传统的PDT过程中ROS的产生依赖于氧气，因此开发非氧气依赖型细胞毒性化合物将为治疗缺氧微环境下的肿瘤提供优势。BABII等［29］报道了一种二芳基乙烯衍生的多肽模拟物，在无氧条件下，该化合物经可见光照射产生ROS。该多肽模拟物由光敏二芳基乙烯和天然多肽抗生素（GS）组成，在紫外线作用下产生的肽仿异构体可对肿瘤细胞产生毒性作用，也对HeLa细胞和人结肠癌细胞COLO-205表现出明显的细胞毒性，肺癌荷瘤小鼠进行PDT治疗20 d后，小鼠存活率提高60%以上。

3 PDT联合其他治疗

3.1 PDT联合化疗

化疗是肿瘤的主要治疗方法之一，但毒副作用较大且易产生抗药性。化疗联合PDT以改善PDT对氧气的依赖及减少化疗药物剂量成为研究的热点之一。替拉扎明（tirapazamine，TPZ）是一种新型的生物还原活性物，在缺氧肿瘤细胞内可被还原成一种具有细胞毒性作用的代谢产物。YANG等［30］研发了一种含有TPZ和PS（IR780）的脂质体纳米复合物，可将药物输送至肿瘤组织内而与PDT协同治疗乳腺癌。体外实验显示，当脂质体纳米复合物在近红外光照射下产生ROS时，可导致4T1细胞缺氧，从而激活TPZ并释放毒性氧化自由基，诱导4T1细胞死亡。顺铂Ⅳ（PtⅣ）是一种可通过紫外线照射或还原剂在铂（Ⅱ）中还原的前药，可在不消耗氧气情况下产生铂（Ⅱ）作为化疗药物，同时诱导ROS生成。XU等［31］研发了一种含有PtⅣ和光敏剂（Ce6）的纳米粒子，该纳米粒子可在HeLa细胞及小鼠正常成纤维细胞L929内产生氧气，在HeLa细胞荷瘤小鼠和人结肠癌细胞HCT116荷瘤小鼠模型中均证实该纳米粒子可产生氧气，并有效改善肿瘤缺氧，提高PDT疗效。上述研究表明，将PDT联合化疗可提高肿瘤中的氧气浓度，进而提高PDT抑制肿瘤生长作用。

3.2 PDT联合血管生成抑制剂

PDT造成的缺氧微环境可激活多种血管生长因子生成，如血管内皮生长因子（VEGF）、环氧合酶-2（COX-2）等，而这些血管生长因子可参与肿瘤新生血管形成，并导致肿瘤细胞对PDT耐受。因此，PDT联合血管生成抑制剂可以阻断血管生长因子作用，减缓肿瘤侵袭，同时提高PDT疗效。LECAROS等［32］使用PDT联合脂质磷酸钙纳米粒（LCP NPS）将VEGF-A的小干扰RNA（siVEGF-A）传递到细胞内，通过降低VEGF-A表达增强PDT疗效。在人舌鳞癌细胞SCC4和SAS两种荷瘤小鼠模型中静脉注射siVEGF-A和PDT纳米复合物，发现经siVEGF-A处理组的VEGF-A表达明显降低，且siVEGF-A联合PDT可显著降低两种荷瘤小鼠模型的肿瘤体积。既往研究显示碳酸酐酶Ⅸ（CAⅨ）在肿瘤中过表达并参与肿瘤细胞生长和侵袭，因此靶向抑制CAⅨ可显著抑制肿瘤细胞生长和转移。鉴于此，JUNG等［33］开发了一种乙酰唑胺（AZ）结合氟化硼二吡咯（BODIPY）的 PS（AZ-BPS）靶向抑制CAⅨ，发现AZ-BPS不仅可定位于过度表达CAⅨ的MDA-MB-231和MCF-7细胞线粒体中，并在660 nm光照射时产生1O2，同时与非靶向的BPS相比，AZ-BPS治疗效果明显增强。在MDA-MB-231荷瘤小鼠体内静脉注射AZ-BPS后同样发现AZ-BPS对肿瘤具有明显抑制作用，证实靶向抑制CAⅨ联合PDT可有效增强PDT疗效。总之，通过阻断血管生长因子作用可明显减缓肿瘤生长，而PDT联合血管生成抑制剂也被证实可作为增强PDT疗效的有效措施。

3.3 PDT联合光热治疗

光热治疗（photothermal，PTT）是将光能（通常在近红外区域）转化为热能，然后诱导细胞凋亡或坏死的一种新型的无创性技术。PTT过程中不需要氧气，因此将PTT联合PDT可成为克服PDT治疗中缺氧的有效方法［34］。ZHU等［35］构建了一种由牛血清白蛋白（BSA）、磺胺类化合物（SAS）和铁卟啉纳米金属有机骨架（NMOFs）组成的新型纳米平台，4T1细胞在激光照射下光热转换效率为40.53%，且在常氧和缺氧条件下，这种新型纳米系统对肿瘤组织均有明显的PDT效应；在4T1荷瘤小鼠模型中静脉注射该纳米复合物，也发现PDT联合PTT对肿瘤生长的抑制作用优于单独使用PDT或PTT。因此，将PDT与PTT结合的治疗方案也是一种可克服肿瘤缺氧环境并增强PDT治疗效果的方案。

3.4 PDT联合肿瘤免疫疗法

肿瘤免疫疗法（cancer immunotherapy，CIT）是一种作用于患者免疫系统以对抗疾病的治疗方法，在肿瘤治疗中受到广泛关注，PDT联合CIT也成为研究的热点［36］。IM 等［37］研究了一种负载光敏剂（Ce6）的介孔二氧化硅纳米颗粒，并用PEG对其表明进行修饰形成纳米复合物（CAGE），以通过调节树突状细胞和破坏癌细胞增强PDT的免疫治疗疗效，结果证实激光照射下CAGE可有效产生ROS；对B16.F1荷瘤小鼠静脉注射CAGE并行660 nm近红外光照射后，肿瘤生长也明显受抑制。因此，将PDT创新性地联合CIT可明显抑制肿瘤生长，从而实现PDT与CIT协同对肿瘤细胞的杀伤作用。

4 小结

PDT具有侵入性小、可重复性及靶向性好等独特优势，在恶性肿瘤治疗中显示了巨大的临床应用前景。但PDT高度依赖于氧气，因此疗效严重受限于肿瘤缺氧微环境。目前大多研究主要通过改善或利用肿瘤缺氧微环境提高PDT疗效，例如通过改善肿瘤缺氧微环境，开发新型PDT模式，如间歇式PDT方式、Ⅰ型PDT疗法及利用非氧气依赖型的细胞毒性化合物减少氧气消耗或不利用氧气等改善肿瘤组织的缺氧而增强PDT疗效，以及通过PDT联合化疗、血管生成抑制剂、光热治疗及免疫治疗等措施增效，但PDT过程中肿瘤组织氧合水平与PDT效率的关系还有待进一步探索。此外，PDT纳米系统设计也尚处于临床前研究，其临床应用仍面临诸多挑战，如光敏剂对正常组织的毒性作用、近红外光穿透深度有限、如何靶向传递纳米粒子等，但随着研究不断深入，相信PDT将成为临床肿瘤治疗的有效补充疗法。