云芝糖肽化学成分的研究进展*

张 圆，孙玉娣，刘 璇，石蓓佳，陆益红**

（1.江苏省食品药品监督检验研究院生物技术药品检验一室，江苏 南京 210019；2.中国药科大学药学院，江苏 南京 210000）

云芝（Trametes versicolor） 又名彩绒革盖菌、杂色云芝、彩纹云芝、黄云芝、灰芝、瓦菌、千层蘑、云蘑等，隶属真菌门（Eumycota） 担子菌亚门（Basidiomycotina） 多孔菌科（Polyporaceae） 栓菌属（Trametes）[1]。具有增强免疫、抑制肿瘤等功效[2]。对云芝化学成分的研究主要集中在云芝子实体中提取的子实体多糖（糖肽）、从液态发酵培养的菌丝体中提取的胞内糖肽和从液态发酵培养的发酵液中提取的胞外糖肽[3]。通过分析云芝糖肽的理化性质、一级结构的化学成分（单糖组成、多糖含量、氨基酸含量、肽含量、核苷和核碱组成、指纹图谱）、二级结构（糖苷键分析、糖肽键的研究）、立体结构（分子量、糖肽蛋白结合态）的研究以及相关化学计量学等方面近年的相关文献，对云芝糖肽的化学成分和研究方法进行综述，为其更广泛的应用提供参考和依据。

1 理化性质

PSP（polysaccharopeptide） 和 PSK（polysaccharide-krestin）是由云芝的液态发酵培养的菌丝体中提取的2种商品化糖肽类物质[2]。PSP是上海师范大学杨庆尧教授于1983年，由菌株Cov-1发酵64 h的菌丝体中通过水提醇沉的方式提取出来[4]；PSK是日本吴羽化学工业公司于1966年，由菌株CM-101发酵10 d的菌丝体中通过水提盐（硫酸铵）析的方式提取出来[4]，二者均具有提高机体免疫功能和抑制肿瘤的活性。

PSK含有氧47.5%、碳40.5%、氢6.2%、氮5.2%[2]，含碳水化合物34%～35%、蛋白质28%～35%、灰分6%～7%和水分7%，其余是还原糖和氨基酸[2]。PSP含有可溶性碳水化合物46%、蛋白质31%、不可燃物质15%[4]。PSP和PSK易溶于水，不溶于甲醇、吡啶、氯仿、苯和正己烷[2]，二者无固定的熔点，加热至120℃以上后会焦化[4]。

2 一级结构化学成分研究

2.1 单糖组成

应用于云芝糖肽单糖组成的分析方法主要有衍生化气相色谱法、柱前衍生化-高效液相色谱法/液质联用法，高效液相色谱-蒸发光散射法（HPLCELSD）、高效液相色谱-示差折光法（HPLC-RI）、薄层色谱法（TLC） 等方法[5-8]。目前柱前衍生化-高效液相色谱法是在多糖分析中最常用的手段，反应操作简便可控，无干扰峰，重现性好，利于定量分析，且衍生产物在质谱检测器中响应较高且稳定，提高了检测的灵敏度和专属性[5]。

李娟等[5]将糖肽经三氟乙酸酸解后，用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP） 柱前衍生，建立云芝糖肽单糖对照HPLC特征图谱，测得含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖 （82.4∶6.3∶193.3∶100.0∶5.3∶4.0∶42.9） 7种单糖；并从单糖相似度、单糖组成摩尔比方面进行研究，结果表明，云芝糖肽与云芝胞内糖肽有明显差异，云芝胞内糖肽的葡萄糖含量远大于云芝糖肽。邹巧根等[6]采用氢氧化钠水解、硼氢化钠还原、还原产物与吡啶-醋酐（1∶1） 发生衍生化反应，得到糖醇乙酰酯衍生物，并进行气相色谱分析，检测得到云芝糖肽（PSP） 中含有6种单糖：葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、木糖、鼠李糖（0.544∶0.188 ∶0.180 ∶0.062 ∶0.018 ∶0.009）。张喆等[7]采用HPLC-ELSD和TLC法对云芝糖肽的单糖组成进行测定，结果表明云芝糖肽由葡萄糖、甘露糖、半乳糖和木糖 （1.000∶0.074∶0.067∶0.017 8） 组成，未检出岩藻糖。Lin等[8]采用ddH2O为流动相，利用HPLC-RI法对云芝菌提取的糖肽粗品进行了单糖组成研究，葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖的比例为 49.21∶17.06∶1.33∶32.40。

2.2 多糖含量测定

目前，云芝糖肽的国家标准采用无水葡萄糖为对照品，用硫酸-苯酚比色法测定总糖[9]。该方法专属性不强，尤其样品中单糖或小分子寡糖会影响多糖含量测定，使测定结果偏高[10]。

由于比色法测定多糖含量易造成结果偏差，李京等[10]采用高效阴离子交换-脉冲安培法测定云芝对照品胞内糖肽中的游离糖含量，从而排除比色法总糖测定中游离糖的干扰，结果未检出游离糖。陈露等[11]采用DNS法，测得云芝胞内糖肽中还原糖的总量，结果高压均质法提取得到的产物还原糖含量为0.4%，而热水提取法未检出。

2.3 氨基酸组成

PSP和PSK均含有18种氨基酸，目前一般采用水解后OPA/AQC衍生化-HPLC测定和氨基酸分析仪2种方法进行氨基酸组成分析[5，12]。

李娟等[5]将云芝糖肽经140℃，4 mol·L-1盐酸溶液酸解2 h后，进行在线OPA衍生化，HPLCUV检测后测得云芝胞内糖肽中含有16种氨基酸，天冬氨酸∶谷氨酸∶丝氨酸∶组氨酸∶甘氨酸∶苏氨酸∶精氨酸∶丙氨酸∶酪氨酸∶胱氨酸∶缬氨酸∶甲硫氨酸∶苯丙氨酸∶异亮氨酸∶亮氨酸∶盐酸赖氨酸（物质的量之比） 为 204.6∶145.6∶137.2∶28.6∶218.7∶63.8∶78.0∶100.0∶12.7∶5.3∶29.2∶5.7∶10.1∶15.0∶35.4∶116.2。Jeong等[12]采用氨基酸分析仪对云芝中的糖肽提取物CV-S2进行氨基酸分析，测得11种氨基酸，不同云芝糖肽柱层析分离产物的肽含量在4.1%～18.5%不等。

2.4 肽含量测定

目前，云芝糖肽的国家标准采用牛血清白蛋白为对照品，用福林酚法测定肽[9]，标准规定云芝糖肽蛋白质含量以牛血清白蛋白计，不得少于11.5%。但该方法的缺点是还原性物质（如葡萄糖、寡糖等）易干扰测定[13]。有文献采用考马斯亮蓝法进行肽含量测定，测得云芝糖肽蛋白含量在约6%[6]。考马斯亮蓝试剂与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合，由于云芝糖肽主要含酸性和中性氨基酸（占比70%），可能造成蛋白含量偏低[13]。为更准确地反应糖肽中的肽含量，可考虑采用测定各氨基酸组成的方法，间接测定肽的含量。

2.5 核苷和核碱组成

云芝糖肽中含有多种核苷和核碱，尤以腺苷具有明显的药理作用，如改善心脑血液循环、防止心律失常、抑制神经递质释放和调节腺苷酸环化酶活性等[5]。

李娟等[5]采用超声法提取云芝糖肽30 min，HPLC法测定出8种核苷的含量，胞嘧啶∶尿嘧啶∶胞苷∶次黄嘌呤∶尿苷∶腺嘌呤∶鸟苷∶腺苷（物质的量之比） 为 147.0∶73.1∶68.0∶100.0∶62.9∶135.4∶42.5∶60.5。杨丰庆等[14]利用毛细管电泳-质谱联用技术测定灵芝药材中8种核苷类成分，可为云芝糖肽的核苷成分测定提供技术参考。

2.6 指纹图谱分析

由于云芝糖肽结构复杂，分子量较大，需要建立分离效率较高的指纹图谱，区分力更强的化学计量学手段，识别共有峰和共有模式，以加强质控[15-20]。

袁萍等[15]建立了毛细管电泳分析云芝糖肽的方法，采用低波长和硼酸盐缓冲液，检测出15个指纹峰，将云芝糖肽与牛血清白蛋白分离。朱丽玢等[16]利用毛细管区带电泳方法将云芝糖肽与市售糖肽类药物进行区分。

目前用质谱法对云芝糖肽进行指纹图谱的分析测定还未报道，相关多糖和糖肽的质谱研究报道可以为云芝糖肽的指纹图谱研究提供有益的参考。

张洪涛等[17]采用快速蛋白液相色谱（fast protein liqiud chromatography，FPLC） 法分离香菇（Lentinus edodes）多糖，对于聚合度高于4的香菇多糖寡糖用电喷雾离子化-碰撞诱导解离质谱（electro-spray ionization-collision induced dissociation-mass spectrometer/mass spectrometer， ESI-CID-MS/MS） 法 测定其分子量，并对其多糖水解机制进行解析。王志军等[18]利用TMS衍生化技术，建立了灵芝GC-MS指纹图谱，检出有机酸、多醇、氨基酸、腺苷、单糖、双糖、糖醇、甾醇等多种物质。张顺伟等[19]将此信息进行化学计量学分析，进行模式识别。杨秋霞等[20]运用傅立叶变换离子回旋共振质谱法（FTICR-MS）对赤灵芝的化学成分进行鉴定，采用ESI负离子模式，建立指纹图谱分析方法，发现萜烯醛、糖、三萜醇、有机酸和三萜酸类成分。这些对于真菌类药物化学成分的研究，可为云芝糖肽的化学组成的进一步探索提供技术支持。

3 二级结构研究

3.1 糖苷键分析

β-1,3/1,6-葡聚糖可通过与免疫系统信号蛋白进行识别进而激活免疫系统实现其生物学功能，故对糖肽进行糖苷键分析具有重要意义[17]。PSP和PSK的多糖部分含α-1,4和β-1,3糖苷键[2]。

目前对于糖苷键的研究，主要分为化学方法（高碘酸氧化、Smith 降解、甲基化分析等）[6，8，12]和仪器分析（飞行时间质谱）[17，21-22]两类。

邹巧根等[6]将云芝糖肽高碘酸氧化产物还原后酸水解，再鉴定水解产物，根据高碘酸的消耗量和甲酸的释放量，从而推知云芝糖肽中可能含有1→4、1→6糖苷键，无1→3糖苷键。

邹巧根等[6]对氢谱和碳谱（1HNMR和13CNMR）进行分析，表明云芝糖肽中含有α-糖苷键和β-糖苷键。Lin等[8]利用傅里叶变换红外光谱（FTIR） 的特征波数，提示PSP中含有β（1→3） 糖苷键。Jeong等[12]运用甲基化-GLC-MS技术，对云芝提取物进行糖苷键分析，测得1→4、1→6糖苷键和1→3糖苷键。

Rau等[22]将云芝糖肽经0.5 mol·L-1的TFA水解后，利用微流四级杆飞行时间质谱（μQTOF/MS）技术测定，表明云芝胞外多糖中1→4糖苷键或1→6糖苷键的存在。高效液相色谱-电喷雾离子化-四级杆飞行时间质谱（high performance liquid chromatography-electro-spray ionization-collision-Q-time-offlight mass spectrometer,HPLC-ESI-QTOF）[17]和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization,MALDI-TOF）[21]技术也成熟应用于糖苷键的研究。

3.2 糖肽键分析

目前，蛋白质糖基化分析分为化学方法和质谱方法[6，23-25]。化学方法是指利用PNGaseF酶（N-糖肽）或β消除反应（O-糖肽）等方法将蛋白质和糖链解离后分别鉴定[24]。利用质谱方法进行完整糖肽分析可以更好地还原生物样品的真实状态。

邹巧根等[6]对β-消除反应前后氨基酸分析结果显示，丝氨酸和苏氨酸的相对含量无明显变化，说明云芝糖肽糖肽键的连接方式不是O-连接[23]。

完整糖肽质谱解析近年来多用于进行糖基化位点的确认、肽段序列分析以及糖链结构分析、蛋白质与糖链之间连接方式的分析[24]。其要求对糖肽片段进行富集，方法包括亲水相互作用色谱（HILIC）、凝集素（lectin） 亲和以及硼酸亲和[25]。质谱检测器一级和二级质量分析器均要有足够宽的质量范围；其次，低质量区的特征碎片离子是糖肽结构研究的重要参照，二级质谱质量分析器需要覆盖低质量区的特征碎片离子质量数[24]。

4 立体结构研究

4.1 分子量

云芝糖肽的重均分子量在100 kDa左右，其分子量分布随测定条件、发酵条件、提取工艺等因素而变化，不是一个绝对值[26]。目前绝大多数文献采用分子排阻色潽法-示差折光检测器（SEC-RI）[26]进行相对分子量的测定。该方法的原理为对照品右旋糖酐保留时间不随流动相盐浓度改变，但结合蛋白多糖的构型及分子形态大小受流动相中电解质（盐）浓度的影响，故云芝糖肽的保留时间会随之改变。从标准曲线上测得云芝糖肽主要组分的分子量大于50万道尔顿。

也有文献尝试利用SEC-示差-激光光散射-黏度检测器（SEC-RI-LLS-DP）[27]测定多糖的重均相对分子质量、回旋半径及含量和多分散系数，或利用分子排阻色谱法-示差-激光光散射检测器（SEC-RILLS）[28]进行绝对分子量的测定，可为云芝糖肽的绝对分子量测定提供参考。

4.2 糖肽蛋白结合态的研究

云芝糖肽中，多糖和蛋白质共价紧密结合，使PSP与云芝子实体多糖或菌丝体胞外多糖中存在非结合蛋白质/肽的混合体系区分开来[29]。多种方法可以验证这一结合态，包括凝胶色谱法、二乙氨基乙基纤维素（DEAE）阴离子交换色谱法以及电泳法[6，9，29]。

杨晓彤等[30]利用凝胶色谱法将糖肽进行液相分离，洗脱液用示差检测器和紫外检测器串联检测，若示差检测器（多糖响应）与紫外检测器（蛋白质响应）同时出峰且峰位完全吻合，则认为糖肽处于紧密结合的状态。

云芝糖肽国家药品标准 [标准文号WS3-228（Z-047） -2003(Z)]的鉴定项目，主要采用二乙氨基乙基纤维素（DEAE）阴离子交换色谱法，分段收集洗脱液，分别加入茚三酮和苯酚-硫酸溶液进行验证，鉴定糖肽联结[9，29]。

邹巧根等[6]将云芝糖肽经琼脂糖凝胶电泳后，结果既呈现出多糖显色特征又呈现蛋白显色特征，而作为对照用的标准多糖样品，只呈现出多糖的显色特征，说明云芝糖肽中有结合态的蛋白。

5 结论

云芝糖肽作为商品化的免疫增强药物和抗肿瘤药物已经使用多年，通过对云芝糖肽的理化性质、化学成分、结构等进行了综述，并对分析方法做出总结。随着对云芝糖肽的研究的不断深入，云芝糖肽的组成、结构和性质会被进一步揭示，统计学方法对复杂药材成分的进一步归纳分析，从而提供对其生产加工各环节更有益的帮助，并对了解云芝糖肽的药理作用提供了化学基础。云芝糖肽必将会有更好的应用前景。