缺氧诱导因子-1α 在骨折愈合中的作用*

田原野 康非吾

骨是血管化程度较高的组织,骨内有丰富的血供来维持其营养和氧浓度，其血供大约占心排血量的10%，但由于闭合性骨折、炎症、感染、肿瘤等许多局部或全身性因素可以造成骨组织内血流中断或减少,从而引发组织缺氧[1]。缺氧作为闭合性骨折后微环境改变的特征之一，其成因主要为供应血管破损、正常的血液供应受到阻断、血液快速凝固成血凝块或血肿[2]；骨创伤部位无法获得足够的氧气以及营养物质供应，逐步变成缺氧状态[3]。如正颌手术LefortI 型截骨手术后鼻腭动脉、腭降动脉被切断，广泛的黏骨膜瓣切开翻起等使骨创伤区域氧分压显著降低至0～10mmHg，其骨折中心区氧分压可降至0mmHg[4]。骨组织在缺氧下会产生一系列代偿反应,如血流再分配、无氧代谢增加等以适应缺氧微环境[5]，作为对局部氧环境进行感受和应答的核心分子，缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)-1α 在骨愈合过程中的骨生成、骨吸收以及骨内血管的生成中均发挥着一定作用。

1.缺氧诱导因子-1α

1.1 缺氧诱导因子-1α 的结构及功能 人体有多种强大的机制来解决组织中缺氧状态下氧气利用率的降低；如(1)增加心输出量和通气量；(2)改善血管生成；(3)提高血液中氧气的承载能力；(4)将有氧呼吸转换为无氧呼吸。在细胞水平上，HIF转录因子家族驱动着骨组织内细胞对缺氧微环境的适应[6]；骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)、成骨细胞以及破骨细胞的分化和功能与缺氧诱导因子密切相关。缺氧诱导因子家族包括3 种α 亚单位：HIF-1α、HIF-2α 和HIF-3α，这三种α 亚 单位通过与HIF-1β 组成异二聚体来发挥其调控作用[7]。其中HIF-1α 和HIF-2α 作为转录活性因子，主要与血管生成相关，但缺氧状态下HIF-2α 的稳定性不如HIF-1α；HIF-3α 则是具有负向调控作用的调节因子[8]，然而这两种HIF 亚单位在骨折愈合过程中的作用尚缺乏深入研究。HIF-1α 包括4 个结构域：其中C 端包括TAD-N 和TAD-C 两个反式激活结构；中间段为受氧依赖调控的降解结构域ODDD；N 末端包括bHLH 域和PAS 域，这两个结构域主要与HIF-1β 的二聚化以及靶基因的结合有关[9]。在常氧条件下，ODDD 结构域中的脯氨酸能够被脯氨酸羟化酶(proline hydroxylase,Phd)羟基化，被Phd 羟基化后能与Von Hippel-Lindau(VHL)连接；VHL 再将HIF-1α 进行泛素化修饰，经过泛素化修饰之后的HIF-1α 将被水解而失去功能[10]。氧分压降低后，脯氨酸的羟基化作用受到抑制，使得HIF-1α 蛋白能与HIF-1β 形成二聚体，从而启动其下游基因表达。此外HIF-1α 也可被一些金属离子(如Mg2+、Ni2+、Cu2+等)、物理因素如超声波和一些细胞因子，包括白细胞介素-1、肿瘤坏死因子和成纤维细胞生长因子等调节[11]。HIF-1α的下游靶基因约有100 多种，包括血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、促红细胞生成素、血红素氧合酶-1、葡萄糖转运蛋白1、内皮素1、转铁蛋白等，这些分子在调节组织内氧的稳态以及恢复细胞内微环境稳定中发挥着重要作用。

1.2 缺氧诱导因子-1α 在骨内的调控机制 现阶段普遍认为的缺氧诱导因子调节骨的代谢机制主要为HIF/ VEGF 通路及HIF/ Wnt 通路。HIF/VEGF 通路调控血管生成与骨的代谢主要涉及成骨细胞和血管内皮细胞的相互信号传递：内皮细胞分泌骨形成蛋白2 促进骨形成，成骨细胞分泌VEGF增强血管生成[12]。在体内实验中，上调成骨细胞中的Phd、VHL 或HIF 可以增加VEGF 和血管生成[13]，敲除成熟成骨细胞中的HIF-1α 会等效地降低VEGF 的表达和血管体积，HIF-1α 高表达可以相应地增加VEGF。在骨组织生物学中，Wnt 信号的转导发生在骨形成过程中[14]，是进行新骨沉积所必需的。已有体内外实验证实HIF-1α 与Wnt信号传导之间的相关性，敲除HIF-1α 的小鼠能通过Wnt/ β-catenin 通路上调骨生成，而VHL和HIF-1α 能协同降低Wnt 信号传导[15]。另有学者发现:低氧或低氧模拟物会增加骨组织中的Wnt信号[16]，HIF-1α 与β-catenin 结合可以阻止Wnt靶基因的转录[17]。尽管这些研究确定了缺氧对Wnt信号的影响，但这也可能是成骨细胞的表观遗传修饰改变所造成的,因此尚需进一步研究。

2.骨折愈合

骨折的愈合过程是断端骨组织的修复再生反应,主要由骨生成相关的成骨细胞、软骨细胞、骨细胞，骨吸收相关的破骨细胞和骨血管新生相关的血管内皮细胞共同参与。骨折愈合过程可分为：①血肿机化期②纤维骨痂形成期③骨性骨痂形成期。血肿机化期主要是骨折两周以内，局部因为骨折出血而形成血肿，然后引起无菌性的反应，形成肉芽组织，并逐渐转为纤维组织，HIF-1α 此时主要引起血管的生成。纤维骨痂形成期，骨内膜及骨外膜形成内、外的原始骨痂逐渐的钙化、骨化，形成环状骨痂及髓腔内骨痂，HIF-1α 此时主要引起大量的成骨细胞在局部聚集，逐渐的形成骨痂。骨性骨痂形成期，在引力的作用下骨痂改造塑形，恢复骨的原形，此时HIF-1α 主要引起破骨细胞和成骨细胞的偶连代谢。缺氧诱导因子-1α 在骨愈合过程中的主要通过与骨生成、骨吸收以及骨内血管的关系来影响骨折愈合。

2.1 骨生成与缺氧诱导因子-1α 的关系 HIF-1α 驱动的信号主要通过成骨细胞、软骨细胞、骨细胞适应缺氧环境来调节及参与骨组织的形成。HIF-1α 可以促进BMSCs 的聚集和骨发育，通过增加Sox9 基因的表达来调节软骨生成[18]。在软骨细胞内敲除HIF-1α 上游的Phd2 或Vhl 的小鼠中[19]，其软骨分化能力增强，二次骨形成的量增加，这可能是由于肥大软骨细胞向成骨细胞分化所以产生了骨量升高的表型。骨祖细胞中Phd1/ 2/ 3基因的个别缺失未能产生骨骼表型，而Phd1/ 2/ 3基因的联合缺失增加了靶基因HIF-1α 表达，血管生成增加、骨小梁密度及微结构发生变化[13]。在敲除Phd2 的前成骨细胞或敲除HIF-1α 的成熟成骨细胞中观察到骨骼的发育畸形或骨密度降低的现象[20]。成熟成骨细胞中的VHL 缺失会导致骨密度升高的表型，可能与增加的血管密度以及成骨速率增加有关。骨细胞内HIF-1α 缺失的小鼠在表型上与野生型对照相似,而敲除骨细胞中Phd2 或Vhl 会使小鼠骨组织中骨量升高[21]。

骨折后缺氧环境中的HIF-1α 将招募BMSCs，并上调其向成骨细胞方向的分化能力[22]。软骨细胞所产生的HIF-1α 能刺激纤维骨痂内的血管新生和软骨基质分泌[23]。在骨折愈合过程中如果出现血管形成异常，成骨细胞将不能正常替代软骨细胞，从而影响软骨基质向骨基质的矿化，骨组织无法正常愈合[24]。HIF/ VEGF 通路主要经由血管生成来影响骨的愈合，也能促进BMSCs 的增殖和迁移，缺氧预处理能够抑制BMSCs 的凋亡，维持BMSCs 的干性[25]。而HIF/ Wnt 通路主要能够调控BMSCs向成软骨方向分化，抑制成骨细胞凋亡，促进其成骨能力[26]。骨细胞在缺氧环境下高表达HIF-1α[27]，并通过JNK 通路上调核因子受体活化因子配体(Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand，RANKL)的分泌，诱导破骨向分化，影响骨的代谢。这些研究结果提示，HIF-1α 可以通过调节骨生成相关细胞来调节骨愈合中的骨生成过程。

2.2 骨吸收与缺氧诱导因子-1α 的关系 破骨细胞在骨吸收和骨重塑中起作用，其功能异常会引起许多骨骼疾病[28]。破骨细胞由髓样造血干细胞融合而成，最主要的调控因子为巨噬细胞集落刺激因子(myeloid colony-stimulating factors,M-CSF)及RANKL，在两者作用下髓样单核细胞附着于骨表面逐渐分化成熟，表达组织蛋白酶、抗酒石酸酸性磷酸酶、基质金属蛋白酶等，进而行使骨吸收功能[29]。成熟的破骨细胞在行使骨吸收功能时，细胞骨架重排，裙皱缘上的质子泵分泌带H+的酸来降解骨组织[30]。破骨细胞由血氧浓度饱和的骨髓中发育而来，逐渐逆氧浓度梯度，在氧分压较低的骨表面或者骨折断端逐渐分化成熟。随着氧分压的逐步降低,抗酒石酸盐染色阳性的多核巨细胞数量明显增加，而且骨吸收陷窝也相对增多,在氧分压达到2%～5%时，破骨细胞前体细胞分化成熟达到最大值，能融合成比常氧状态下体积更大，细胞核数量更多的破骨细胞[31]。缺氧状态下破骨细胞分化成熟和骨吸收能力的增强可能与破骨细胞体积的增加、核数量增多、基因及蛋白表达量升高有关。缺氧可以改变细胞外酸性环境，缺氧组织中的无氧呼吸所产生的酸也能与缺氧相互协同作用[32],共同促进破骨细胞的分化，影响骨的吸收。

在骨折愈合时，HIF-1α 所募集的破骨细胞启动骨痂的重塑，纤维骨痂逐渐被编织骨替代[33]，加快骨痂吸收和重塑可在一定程度上促进骨折愈合。激活HIF-1α 既能增加破骨细胞的数量又能增加其活性，使破骨细胞分泌更多的基质金属蛋白酶和组织蛋白酶等，提高破骨细胞在吸收死骨和骨重塑的效率。骨的吸收是一个耗能过程，HIF-1α 的表达能够通过增加葡萄糖和谷氨酰胺载体的转录、增加糖酵解和谷氨酰胺的分解并产生ATP[34]，这也可能是HIF-1α 调节破骨细胞活性的机制之一。此外，HIF-1α 能够上调趋化因子及其受体的表达，趋化因子及其受体可以促进骨祖细胞与破骨细胞的募集、维持骨祖细胞与破骨细胞之间的黏附作用及生理稳态[35]。以上研究提示，骨折修复过程中，HIF-1α 和相关因子将募集破骨细胞，调节骨细胞的骨吸收能力，起到调节骨折愈合的作用。

2.3 骨内血管生成与缺氧诱导因子-1α 的关系 骨折部位的机械刺激、炎症信号以及由于氧和营养的供应被中断所导致的缺氧环境将启动骨的修复，当血管形成异常，骨组织将无法正常愈合，出现骨不连、骨坏死、骨折愈合延迟等情况[36]。氧气和营养供应的中断可以使HIF-1α 蓄积，这对刺激血管和新骨形成有重要意义。在骨折的早期阶段，HIF-1α 在骨折断端表达升高，骨折10d 达到峰值。牵张成骨模型中，骨切开后HIF-1α/ VEGF被激活，VEGF 促进血管内皮细胞增殖分化，维持骨痂内的血氧供应，保障骨愈合的正常进行[37]；在骨的牵张期间上调HIF-1α 能刺激更多的血管和新骨形成，血管和骨质密度明显升高；而在特异性HIF-1α 基因敲除鼠中，牵张成骨的部位血管数量减少、骨密度降低，出现编织骨无法正常替代纤维骨痂，出现骨折愈合延迟[38-39]。利用缺氧模拟物(去铁胺)能够抑制脯氨酸羟化酶，从而阻止脯氨酸羟化酶对HIF 的降解，使HIF-1α 蓄积激活缺氧相关通路，可以有效地刺激新生血管形成提高牵张成骨中的骨质密度[40]。以上研究提示，骨折愈合时HIF-1α 通过刺激VEGF 来调控骨内血管的生成，保证新生骨的血氧和营养物质供应，保障骨愈合正常进行。

3.结语

迄今的大量研究已经证明骨组织中的缺氧信号对于骨折的修复至关重要；HIF-1α 可以影响骨内的成骨相关细胞、破骨细胞以及骨内的血管生成，HIF-1α 相关信号通路的异常会导致骨折的愈合障碍。虽然骨折的愈合是一个缓慢而复杂的过程，但是有望通过药理学手段调控HIF/ VEGF 通路及HIF/ Wnt 通路改变骨折愈合进程，加速骨折修复。总之,在骨折的愈合过程中，缺氧诱导因子起到了一定的作用，调节骨折内的缺氧代谢环境或缺氧诱导因子有望成为一种新的促进骨折愈合的方法。