唾液检测和唾液组学在唾液腺疾病研究中的应用

朱 慧 俞光岩

作者单位：100081北京大学口腔医院口腔颌面外科（俞光岩为通讯作者）

唾液是人体三大体液（血液、尿液和唾液）之一，唾液腺疾病直接影响唾液腺的功能，从而影响唾液的流率和成分。唾液的分泌量和成分的变化，以及唾液中所含的多种生物标志物，可以反映患者相关组织器官的病理状态和疾病进程。唾液活检是在患者静止状态下取其自然分泌唾液，检测其中与疾病相关的分子标志物，从而指示疾病的诊断和预后的方法。近些年来，唾液活检及唾液组学逐渐应用于唾液腺疾病的诊断、病情监测及预后判断。本文将近期反映唾液活检及唾液组学在唾液腺疾病研究中的应用现状及进展的相关文献做一综述，并就相关问题进行讨论。

一、唾液活检和唾液组学与唾液腺肿瘤

唾液腺肿瘤大多数系上皮性肿瘤，因其具有易于造成瘤细胞种植的特点，术前一般不做活检。因此长期以来学者们探索切取活检以外的诊断方法，包括影像学诊断、细针吸活检等。也有一些学者尝试采用唾液检测来帮助诊断唾液腺肿瘤。

在出现临床症状之前，唾液腺肿瘤患者的组织、血浆、唾液中的miRNA、蛋白质及其他代谢物有可能已经发生改变。Grimaldi等[1]报告，腮腺肿瘤患者的唾液中L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、肌醇、L-缬氨酸、甲酸盐、琥珀酸盐含量明显异常，可能与肿瘤细胞糖代谢途径改变有关。

有学者将唾液转录组学用于唾液腺良恶性肿瘤的鉴别。Matse等[2]提取29例良性、38例恶性腮腺肿瘤患者全唾液中的miRNA进行分析。结果显示，与良性肿瘤相比，恶性肿瘤患者唾液中miRNA表达量更多；57种miRNA的表达在良恶性肿瘤之间存在差异，其中54种系恶性肿瘤患者的表达高于良性肿瘤，仅3种miRNA的表达良性肿瘤高于恶性肿瘤。选取差异表达最显著的9个miRNA做进一步验证，结果显示恶性肿瘤的hsa-miR-374，hsa-miR-222，hsa-miR-15b，hsa-let-7g，hsa-miR-132和mmu-miR-140-5p表达显著增高（P＜0.05）。采用hsa-miR-132，hsa-miR-15b，mmu-miR-140和hsamiR-223联合检测，区分良恶性唾液腺肿瘤的敏感性和特异性分别为69%和95%（AUC＝0.90）[2]。以上研究结果提示，唾液miRNA检测可能成为鉴别唾液腺良恶性肿瘤手段之一，但是不同类型的唾液腺肿瘤是否具有特异性较强的唾液miRNA，能否作为评估唾液腺良恶性肿瘤的生物学指标尚需深入研究。

唾液腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic adenocarcinoma，SACC）是唾液腺最常见的恶性肿瘤之一，具有生长缓慢、浸润性强、血行性转移率高、手术切除后易于复发等特点。手术治疗后发生血行性转移的时间长短不等，难以预测。因此，一些学者试图探索能够预测转移风险和患者预后的生物标志物。MYB易位是目前研究较深入的影响SACC预后的分子机制。在SACC中，约50%患者存在MYB/NFIB基因融合，而MYB的过表达率高达80%[3]。Wang等[4]的研究结果显示，MYB是SACC中上调miR-130a表达的关键因子，miR-130a可以靶向NDRG2基因的3’UTR区，使NDRG2表达降低，从而促进SACC的增殖和转移。MYB过表达后，CDH1表达下调，CDH2、VIM、ACTA2表达上调，促进上皮间质转化过程，促进肿瘤肺转移[5]。目前未见唾液中MYB表达的研究。

表观遗传学和转录组学也用于SACC侵袭和转移机制的研究。Feng等[6]的研究结果显示，miR-205在原发性SACC组织中高表达，而miR-155和miR-342在复发性SACC组织中高表达。也有研究显示，miR-181a、miR-582-5p、miR-140-5p、miR-125-5p等小分子RNA可以抑制SACC细胞的增殖、侵袭和迁移，在SACC组织中表达下调[7~9]。miR-155可以加快细胞周期进程，在SACC组织中表达上调，miR-17、miR-20a等miRNA表达升高常提示预后不良[10]。miR-21在多种肿瘤中过表达，Yan等[11]的研究结果显示，miR-21可能通过靶向PDCD4、PTEN、Bcl-2基因促进SACC的进展。Fu等[12]报告，miR-103a-3p的过表达通过靶向TPD52促进SACC细胞迁移和上皮间质转化。Sun等[13]认为，miR-320a通过靶向ITGB3基因抑制SACC转移，与低肺转移性ACC2和SACC-83细胞相比，高肺转移性ACCM和SACC-LM细胞中的miR-320a表达下调，且miR-320的低表达预示了患者的低生存率。Brown等[14]通过定量PCR研究了miR-150，miR-455-3p和miR-375的表达，探讨SACC和多形性腺癌（polygonal adenocarcinoma，PAC）之间可能存在的分子差异。结果显示，与正常唾液腺组织相比，SACC和PAC中miRNA-150和miRNA-375的表达显著降低，而与PAC相比，SACC中的miRNA-455-3p表达显著增加，可通过miRNA-455-3p检测与免疫组化相结合，来鉴别诊断SACC与PAC。但以上研究主要基于SACC患者的肿瘤组织中miRNA的改变，唾液中的miRNA是否能用于SACC的鉴别诊断和预后判断尚未见报道。

SACC-83细胞系是国内最常用的腺样囊性癌细胞系之一。有研究表明，SACC-83细胞来源的外泌体具有细胞间交流通讯与调节肿瘤生长、侵袭和转移的功能，肿瘤细胞摄取SACC-83细胞来源的外泌体后，细胞的增殖能力显著提高，这可能与细胞外信号调节激酶的活化以及丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶信号通路的激活相关[15]。宋梦阳等[16]的研究显示，宿主细胞吸收SACC-83细胞来源的外泌体后，细胞间紧密连接相关蛋白claudin5和ZO-1的表达下调，细胞间连接松解，从而促进上皮间质转化的进程，同时血管内皮屏障被破坏，内皮细胞的通透性增强，肿瘤的侵袭能力增强，促进肿瘤的血行性转移。MRPL23-AS1是一种长非编码RNA，在SACC组织中高表达，并与肺转移和患者总生存期相关，是EREG基因的下游lncRNA。MRPL23-AS1通过与ZEST同源增强子2（EZH2）形成RNA-蛋白质复合物，正向调节上皮-间充质转化。此外，SACC患者血浆外泌体中的MRPL23-AS1水平较高，外泌体中MRPL23-AS1通过“外分泌”的方式作用于肺微血管内皮细胞，增加其通透性，促进SACC的体内转移[17]。腺样囊性癌患者唾液中的外泌体是否具有调节肿瘤生长、侵袭和转移的功能，尚需进一步研究。

二、唾液活检和唾液组学与IgG4相关唾液腺炎

IgG4相关唾液腺炎（IgG4-related sialadenitis，IgG4-RS）是近年来被认识的一种自身免疫性疾病，主要累及下颌下腺、腮腺、舌下腺和泪腺，表现为多发性外分泌腺肿大，常为双侧，患者唾液流率常降低，部分患者伴鼻窦炎、听力下降、颈淋巴结肿大等表现[18]。系统性IgG4-RS常伴有内脏器官受累，其中以肺部和胰腺病变较多见[19]。多数患者血清IgG4及IgE水平升高，但自身抗体常为阴性。下颌下腺或腮腺组织病理学和免疫病理学是诊断的“金标准”[20]。组织病理学显示腺泡萎缩，弥漫性淋巴浆细胞浸润，淋巴滤泡形成，可见地图样生发中心；腺体内广泛席纹状纤维化，导管周围可见胶原鞘，合并血栓性静脉炎。免疫组化表现为大量IgG、IgG4阳性浆细胞浸润，IgG4+浆细胞计数>50/高倍视野，IgG4+/IgG+细胞比例＞40%。临床上综合临床表现、组织学和免疫病理学特征、实验室和影像学检查结果做出IgG4-RS的诊断。

IgG4-RS是免疫介导的系统性疾病，其治疗采取以糖皮质激素为主的免疫调节治疗，疗效显著，疗程较长。Hong等[21]报告43例经免疫调节治疗的患者，治疗后所有患者肿大的唾液腺和泪腺明显缩小，唾液分泌增加，血清学IgG4水平明显下降。长期维持治疗过程中，血清IgG4水平与病变复发密切相关。因此，血清学IgG4和IgE水平不仅是IgG4-RS诊断的重要指标，而且是患者随访观察过程中病情监测、药物剂量调整的重要依据。患者需3~6个月复查IgG4及IgE水平，目前采取血清学检测。唾液直接来源于受损伤的唾液腺，唾液组学在系统性红斑狼疮及干燥综合征等自身免疫性疾病中已有应用的报道。而IgG4-RS患者唾液中的IgG4和IgE水平是否与血清水平相平行，唾液检测能否替代血清检测，从而提高病情监测的无创性和方便性，是非常值得研究的课题。

三、唾液活检和唾液组学与干燥综合征

干燥综合征（Sjögren's syndrome，SS）是一种以淋巴细胞浸润外分泌腺，尤其是唾液腺和泪腺为特征的自身免疫性疾病，患者常出现口干、眼干等症状。约1/3的SS患者会出现肺、肝、肾、神经、关节等多系统损害。目前对SS的发病机制尚无定论。从免疫角度来看，SS患者异常的B细胞过度活跃，产生自身抗体，并通过T细胞和干扰素途径的激活，来增强免疫反应，SS患者血清中干扰素-α水平明显升高。

唾液活检在SS的诊断中显示出应用前景。目前在临床上常用的生物标志物，如抗Ro/SS-A、La/SS-B抗体，类风湿因子和抗核抗体，有一定的局限性，在疾病早期，敏感性和特异性相对较低。SS患者的唾液中也存在这些自身抗体。有的自身抗体可能在患者出现症状之前即已出现，具有早期诊断价值[22]。组织特异性抗体阳性可以帮助识别抗Ro/SSA抗体阴性的SS患者，SS患者的唾液中抗CA-6、SPI及PSP抗体的含量均显著增加，这也提示组织特异性抗体在唾液腺损伤中发挥作用[23]。

唾液代谢组学、转录组学、蛋白质组学、微生物组学在SS诊断中均显示出有意义的变化。SS患者唾液中酪氨酸、尿酸、海藻糖的含量低于健康对照组[24]。miR-146a在SS患者的唾液中的表达高于健康对照组，miR-17、18a、146b的表达可能发生改变，并 且 与 超 声 表 现 和ESSPRI（EULAR Sjögren’s syndrome patients reported index）评分以及抗La/SS-B抗体阳性有关[25]。在蛋白质组学方面，胱抑素S、α-烯醇化酶、β2-微球蛋白等可能是SS的唾液标志物，但未被临床证实。Lee等[26]的研究结果显示，可溶性唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素（siglec）-5在SS患者的唾液中高表达，siglec-5可以调节免疫细胞功能。Moreno-Quispe等[23]测定36例SS患者和35例健康对照者唾液中的细胞因子，结果显示，白介素-6在SS患者中显著升高。Sembler-Møller等[27]对24例SS患者和16例有口眼干燥症状但不符合SS诊断的对照者的唾液进行液相色谱串联质谱分析。结果显示，唾液中存在40种差异表达的蛋白质，其中中性粒细胞弹性蛋白酶、包含三重基序的蛋白质29和钙网蛋白三种蛋白质组合后，区分SS和非SS患者的准确率达到97%。Selifanova等[28]的研究结果显示，检测腮腺分泌的唾液中的淋巴细胞分型可以区分SS患者和健康对照者，其敏感性为77.5%，特异性为100%，阳性预测值为100%，阴性预测值为69%。

唾液活检和唾液组学有助于对SS发病机制的深入研究。Aqrawi等[29]使用液相色谱-质谱法对27例SS患者和32例健康对照者的唾液和泪液进行分析。结果显示，SS患者唾液中中性粒细胞明胶酶相关脂蛋白（LCN2）表达上调，LCN2是与先天免疫系统和中性粒细胞激活相关的铁结合蛋白，该结果支持SS的发病可能与病毒感染相关的观点[30]。唾液来源的细胞外囊泡中还存在激活先天免疫系统和脂肪细胞分化的生物标志物，与SS患者唾液腺中淋巴细胞浸润与脂肪细胞替代等病理机制相关[29]。

唾液活检还可以用于SS的预后判断。少数SS患者可能发展为黏膜相关淋巴样组织淋巴瘤（mucosal-associated lymphoid tissue lymphoma，MALT）。由SS转变为MALT患者的唾液中，抗cofilin-1和α-烯醇酶抗体，以及Rho GDP解离抑制剂2的表达水平显著升高，由此可以预测SS向MALT淋巴瘤进展的可能性[31]。抗黏液病毒蛋白1（anti myxovirus protein 1，MX1）是干扰素抗病毒反应的主要介质，受到Ⅰ型干扰素的强烈调节。MX1被认为是评估SSⅠ型干扰素生物活性的最实用的生物标记物。Maria等[32]的研究结果显示，活跃的SS患者，其MX1水平高，高水平的MX1与欧洲风湿病联盟评分得分高及类风湿因子水平等其他实验室参数具有相关性。而Aydemir等[33]未发现唾液与血清中MX1的水平与SS的活动性有关，其原因可能是受患者不同治疗方式的影响。如果能够发现反映SS疾病状态的生物标志物，则对SS患者个性化治疗策略的制定和实施，以及对疾病转归的预判发挥重要作用。

四、结语

综上所述，唾液活检和唾液组学对唾液腺疾病的诊断、疾病检测和预后判断具有良好的应用前景。目前在唾液腺肿瘤的唾液活检方面，已有一些研究报告，但研究目标多为探索良恶性肿瘤间生物标志物的差异，提出的分子标志物数量多，结果分散，尚缺乏与肿瘤密切相关的确切的标志物。在临床应用较为困难，尚不能取代组织病理活检用于临床诊断。对SACC的研究多集中在各类lncRNA、miRNA的差异比较及其与侵袭和转移的可能关系，对于唾液外泌体尚缺乏研究。而唾液中尤其是唾液外泌体中含有蛋白质、DNA、mRNA、lncRNA、miRNA等多种生物标志物，在口咽癌、肺癌等多种肿瘤中已有研究报道，现已开发通过检测唾液进行肿瘤诊断的装置[34]。80%的HPV阳性口咽癌患者的唾液外泌体中可以检测到HPV-DNA[35]。今后宜在原有基础上进行聚焦，集中若干个关键问题进行深入研究，诸如影响多形性腺瘤恶变的关键因子以及唾液外泌体中可用于SACC远处转移预测的关键分子的探索等。

对于IgG4-RS和SS，目前临床诊断和病情监测中多参考血清学抗体检查，而唾液中亦含有多种免疫球蛋白，深入研究唾液检测与血清检测的相关性和平行性、唾液中各类抗体与疾病状态的相关性以及与组织病理学严重程度的相关性，探讨唾液检测替代血清检测的可能性，将其用于患者随访和病情监测，将是非常有意义的。