CRISPR/Cas技术在木本植物改良中的应用

侯 静， 毛金燕, 翟 惠, 王 洁, 尹佟明

(南京林业大学林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室，南方现代林业协同创新中心，南京林业大学林学院，江苏 南京 210037)

木本植物是生态环境的重要组成部分，在维持碳氧平衡、保护生物多样性、涵养水源等方面起着重要作用，同时林木的推广与利用对于我国绿色经济建设也具有重要意义。随着人民生活水平的提高，对林产品的需求量逐渐增多，对其质量的要求也越来越高。林以种为本、种以质为先，优良种质是林业发展的基础和前提。多年来，育种学家通过杂交育种、诱变育种和多倍体育种等传统育种方法进行良种选育。由于木本植物具有世代周期长、遗传负荷高、基因组倍性复杂等生物学特点，良种选育周期很长，盲目性比较大，结果也不太理想，难以实现快速育种的目标[1]。CRISPR/Cas系统是近年来发展起来的能够实现对基因组进行精准定点编辑的技术，具有操作简单、制作成本低、周期短、效率高等优点，利用该技术可以实现基因敲除、插入或替换以及染色体重组[2-3]，还可以对目的基因进行转录调控和表观遗传调控，从而精确引入目标性状[4-5]。目前，CRISPR/Cas技术已在多种动物、植物以及其他生物中得到了成功应用，其中植物包括24科45属[6]，明显改善了植物产量、品质、抵抗生物和非生物胁迫等性状，获得了大量具有优良性状的新品种，实现了种质资源的原始创新[7]。笔者对CRISPR/Cas技术在木本植物中的应用进展进行总结，分析了存在的问题和未来发展的趋势，以期为木本植物基因功能研究及品种改良提供有益参考。

1 生长性状改良

植物生长的快慢直接决定产量的高低，研究人员通过尝试不同的方法来提高植物生长速率。生物固氮在提高产量、降低化肥使用量、减少污染等方面具有重要作用。豆科植物是经典的生物固氮模式，如何将这种机制引入非豆科植物建立非豆科植物的固氮新体系是“国际生物学计划”的重点研究内容。通过不断研究发现除了豆科植物，还有一种非豆科植物糙叶山黄麻(Parasponiaandersonii)也可以进行生物固氮。糙叶山黄麻是一种快速生长的热带大麻科(Cannabaceae)树种，可作为模式体系进行非豆科植物共生固氮研究。通过比较基因组学分析发现，山黄麻中存在4个在豆科植物中与根瘤菌共生相关的同源基因(PanHK4、PanEIN2、PanNSP1、PanNSP2)。为了进一步确定4个基因在山黄麻中的功能，Zeijl等[8]利用CRISPR/Cas9分别对糙叶山黄麻PanHK4、PanEIN2、PanNSP1、PanNSP2进行敲除，双等位基因突变率为34.5%～66.7%。根据突变系的性状表现确定Panhk4与原瘤活性相关，PanEIN2控制性别分化，PanNSP1和PanNSP2是结瘤形成的关键基因，极大地推动了非豆科植物共生固氮系统研究进展，为共生固氮系统到非豆科植物体内的转移提供了理论依据。

植物光合作用是有机物合成的主要途径，主要包括光反应和暗反应两个阶段，涉及光捕获、电子传递、光合磷酸化、碳同化等重要反应步骤。类胡萝卜素在光捕获阶段扮演着重要的角色，而八氢番茄红素脱氢酶(PDS)是类胡萝卜素合成途径中的首要限速酶，可以催化八氢番茄红素从没有颜色的状态转变成有色状态的类胡萝卜素。为了进一步验证PDS基因在光合作用中的功能，2015年Fan等[9]通过CRISPR/Cas9技术实现了对杨树中PtoPDS基因的敲除，突变效率达到51.7%，突变植物具有明显的白化表型，成功地证明了PDS基因在类胡萝卜素合成途径中的重要作用。随后研究人员利用CRISPR/Cas9敲除技术在苹果(Malusspp.)[10]、木薯(Cassavaspp.)[11]、葡萄(Vitisvinifera)[12]等物种中均获得了具有白化表型的PDS基因突变株。目前，PDS基因已成为检测植物遗传转化体系及CRISPR/Cas9系统突变效率的指示基因。

植物激素影响细胞的分裂、伸长和分化，对植物的生长发育具有重要的调控作用。独脚金内酯是最新发现的植物激素，通过农杆菌介导CRISPR/Cas9系统分别对欧美杂种葡萄(Vitisviniferacv. Chasselas ×Vitisberlandieri)胚性细胞中两个独脚金内酯基因VvCCD7和VvCCD8进行敲除，得到的突变系植株产生分枝的数量明显多于野生型的分枝数[13]。除了独脚金内酯，植物体内存在自上而下的生长素浓度梯度和自下而上的细胞分裂素浓度梯度，两者协调作用，维持着植物的正常生长和分枝。这两种激素之间存在复杂的调控网络，在木本植物中的研究较少，利用CRISPR/Cas技术有望解析生长素和细胞分裂素对木本植物生长的调节机制。2017年Finlayson[14]通过对拟南芥(Arabidopsisthaliana)的研究发现，TCP型转录因子(BRANCHED1、BRANCHED2)可以通过抑制芽的生长来影响植物的株型，但相比于BRANCHED1，BRANCHED2的作用较小。2018年Muhr等[15]以杨树(Populusspp.)为研究材料，利用CRISPR/Cas9 技术分别对杨树两个同源基因BRANCHED1-1和BRANCHED2-1进行敲除，两个基因的敲除突变体不仅增强了芽的生长，还对叶的发育具有一定影响。另外，与拟南芥相反，BRANCHED2在杨树中的作用比BRANCHED1大，突变株的表型更加明显[15]。这一结果表明同源基因的功能在不同物种中可能相似，但也可以进化成不同的特征，特定的基因需要在其所属物种中进行研究，才能明确该基因的功能。

2 材性性状改良

木本植物的次生生长决定着木材的产量，具有重要的经济价值。次生生长是一个复杂的细胞分化、发育过程，包括次生细胞壁形成、木质化(木质素沉积)、细胞程序化死亡(PCD)及心材形成等，这一过程涉及多个转录因子家族、植物激素及大量的功能基因[16]。由于林木生长周期长、基因整合相对困难，次生生长相关基因及转录因子的研究主要以拟南芥为主，但由于拟南芥是1年生草本植物，没有真正的次生生长，同时缺少某些木材形成的基因和相关的生物学过程，不能全面展示多年生木本植物次生发育的特点。CRISPR/Cas9技术的出现为木本植物基因功能研究提供了平台。NST/SND在拟南芥中是木质部纤维细胞次生细胞壁形成的主要调节因子。2019年Takata等[17]以山杨(Populusdavidiana)为研究材料对4个与拟南芥直系同源的NST/SND进行敲除，验证其在木本植物中的功能。通过观察发现，敲除突变体中木质纤维、韧皮部纤维和木质部射线薄壁细胞中的次生细胞壁较薄，有的细胞中甚至没有形成次生细胞壁，进一步证实了NST/SND在木本植物中具有调控木材纤维、木质部射线薄壁细胞和韧皮部纤维中次生细胞壁形成的功能。毛白杨(Populustomentosa)中的PtoMYB156是R2R3-MYB的转录因子，利用CRISPR/Cas9系统对PtoMYB156进行敲除时，毛白杨突变植株中木质素、木聚糖和纤维素在次生细胞壁形成过程中出现异位沉积，研究结果表明PtoMYB156对杨树次生细胞壁的形成起负调控作用[18]。植物4-香豆酸：辅酶A连接酶(4CL)是苯丙烷衍生物，如类黄酮和木质素等合成途径中的关键酶。杨树中有两个4CL基因(4CL1和4CL2)，通过表达模式分析发现4CL1主要在木质部表达，而4CL2则在幼叶表皮细胞中表达。利用CRISPR/Cas9系统对杨树717(Populustremula×albaclone 717-1B4)4CL1基因功能进行敲除验证，观察并统计4CL1敲除突变株表型发现其茎杆均呈现红棕色，而且木质素含量降低了23%。木质素含量降低会改变木质素单酚的含量，进而使植株茎杆变色，这一颜色变化可作为木质素含量变化的性状指标[19]。目前，利用CRISPR/Cas9技术虽然对一些木材形成相关基因的功能进行了验证，但这一过程涉及的基因众多，要准确揭示每个基因的功能及它们之间的相互联系，通过单个基因和多个基因的突变表型进行验证，需要大量的人力、物力和时间的投入。利用高效便捷的CRISPR/Cas9基因编辑技术和高通量的寡核苷酸芯片合成技术可以大规模地对木材形成相关基因及转录因子进行编辑，开展大型突变体库的创制工作，实现突变体的高通量构建和功能筛选，通过所获得的特定性状的突变体来确定控制特定性状的基因，对基因功能作出相应分析，进而了解所有基因如何协调发挥作用，完成一系列的次生生长发育过程，解析木材形成机制。

3 抗性性状改良

3.1 抗病性改良

植物病害是影响产量和品质的主要因素之一，目前主要通过化学方法进行防治，但化学杀菌剂不仅污染环境，还会诱导病菌产生抗药性，破坏生态平衡，因此植物抗病新品种的选育迫在眉睫。CRISPR/Cas技术的出现为优良品种的选育开辟了一条崭新的途径。柑橘(Citrusreticulata)溃疡病是由柑橘黄单胞菌柑橘亚种(Xanthomonascitrissp.citri，简称Xcc)引起的破坏性极强的柑橘细菌性病害。Xcc主要通过气孔和微伤口进入植物内部，造成果实、叶片和茎产生坏死性溃疡病斑，感病严重时会导致枝叶枯萎、落叶、落果等现象，严重影响了柑橘的品质和产量，给柑橘产业带来了巨大的经济损失[20]。通过研究发现PthA4和CsLOB与柑橘溃疡病的发生有关，PthA4是一类转录激活类效应因子，CsLOB1隶属于LBD(lateral organ bourdries domain)家族，是植物体内易感基因。PthA4可以靶向CsLOB启动子中的效应因子结合位点，诱导CsLOB基因的表达，导致柑橘溃疡症状发生。2017年Jia等[21]利用CRISPR/Cas9对柚子(Citrusmaxima)的CsLOB基因进行编辑，得到了6个转基因株系，编辑效率为23.80%～89.36%，由于每个株系CsLOB基因突变位置对功能的影响不同，导致不同的突变系对溃疡病的抗性也不同。因此在设计sgRNA时，需尽量靠近基因编码区的ATG下游，最好位于第1或第2个外显子，通过移码突变造成基因功能的缺失，提高突变效率，得到更多的阳性克隆，便于后期的筛选和鉴定。CsLOB启动子是PthA4的结合位点，随后Peng等[22]通过CRISPR/Cas9技术对柑橘中CsLOB1基因的启动子序列进行敲除，突变植物对柑橘溃疡病的抗性明显增强，有的突变系甚至可以完全抵抗Xcc的入侵。通过测序分析发现，突变植株的抗性强度与CsLOB1基因启动子的突变率有关，双等位基因突变体或纯合突变体抗性最强，但仅占5.3%，绝大部分突变体为嵌合体，比例高达73.7%。另外，在柑橘基因组中检测到了205个脱靶位点。因此，对CRISPR/Cas9体系需要进一步改善来降低嵌合体和脱靶现象的产生。CRISPR-Cas12a是最新兴起的基因组编辑技术，是CRISPR-Cas9的互补系统。利用CRISPR-Cas12a编辑柚子CsLOB1基因的启动子序列，突变株系也表现出对柑橘溃疡病具有较高的抗性。与CRISPR-Cas9编辑相比，两个系统造成碱基丢失的数目相似，但CRISPR-Cas12a双等位基因突变体的概率更低，仅为5%[23]。虽然CRISPR-Cas12a在柚子抗病性研究中有一定前景，但编辑效率的提高是今后应用的前提。

疫霉菌是一群重要的植物病原菌，寄主范围很广，包括林木、蔬菜、花卉、中草药材等上万种植物。疫病破坏性极强，危害性较大，常见症状有叶斑、枝枯、果腐、根腐、心腐、茎溃疡及其他营养器官的腐烂等，严重时导致全株死亡，造成重大经济损失。因此，世界各国的学者对疫霉菌的致病性及其所致病害的控制方面进行了大量研究[24]。可可树(Theobromacacao)作为生产可可豆的热带树木，是数十亿美元巧克力产业的中心。疫霉菌对可可树的侵害可以摧毁一个农场上所有的可可豆。为了提高可可树对疫病的抗性，研究人员对可可免疫反应机制进行了广泛探索，找到了一些可可病原体受体基因和下游途径的其他组分，其中NPR3为水杨酸结合蛋白，抑制病原体防御反应[25]。Fister等[26]利用农杆菌介导的瞬时转化在可可树叶片组织中引入CRISPR/Cas9系统对TcNPR3进行敲除，敲除率达27%。通过对瞬时转化的组织进行测序分析发现，可可基因组只有TcNPR3基因发生了编辑，没有出现脱靶现象。TcNPR3突变后的组织对疫霉菌感染的抗性增强，下游防御基因的表达量也有所升高。这一研究表明使用高效且特异的sgRNA不仅可以提高CRISPR/Cas9的基因组编辑效率，还可以降低脱靶风险，因此，sgRNA是基因组编辑成功与否的关键性因素之一。

灰霉病是由灰葡萄孢(Botrytiscinerea)引起的可危害果树、花卉、蔬菜等多种植物的重要病害。长期以来，灰霉病的防治主要依赖多菌灵、速克灵等化学药剂，但由于病菌抗药性迅速产生，其防治效率大大下降[27]。随着CRISPR技术的发展，大量研究人员开始利用此技术培育抗病新品种。WRKY蛋白是一类植物特有的转录因子家族，共有74个成员。病原菌、伤害以及植物激素类物质等多种外界因素均能诱导WRKY基因的表达，在生物和非生物逆境激发的应激反应中起着重要作用[28]。Wang等[29]设计了4个sgRNA用于CRISPR/Cas9系统对汤普森无核葡萄(Thompson Seedless)基因组中VvWRKY52转录因子基因的敲除，获得了22个突变植株，其中15个株系为双等位基因突变，7个株系为杂合突变，共有72个T-DNA插入突变，没有出现脱靶现象。为了确定VvWRKY52在生物胁迫中的作用，将灰葡萄孢接种在突变株与野生型植株上，表型观察结果显示这些T0代转基因植株均表现出对灰霉病的抗性。通过对不同突变株系中目标序列的GC含量进行分析，发现50%～70%的GC含量通常会导致较高的编辑效率，因此，在利用CRISPR/Cas9系统进行基因组编辑时需要考虑目标序列GC含量对编辑效率的影响[29]。

白粉病是真菌性病害，菌种种类繁多。该病主要危害植株的叶片，严重时对植株的幼芽、嫩梢、花蕾、幼果等部位也会产生危害，造成植株落叶、顶芽枯死、新梢干枯、花芽不能形成、树势衰弱、生长停滞、产量大减。葡萄白粉病由葡萄钩丝壳菌(Uncinulanecator)侵染所致，是危害葡萄生产业的主要病害，在全国各地几乎都有分布，给果农造成了巨大损失，为此，大量学者开展葡葡白粉病的防治工作。通过对葡萄抗病机理的研究发现葡萄基因组中存在易感基因MLO-7[30]，以前研究中利用RNA干扰(RNAi)技术降低葡萄VvMLO7基因的表达量，增强了葡萄对白粉病的抗性，感染率下降了77%[31]。由于RNAi技术的高脱靶性，使其很难实现新品种创制。为了繁育葡萄抗白粉病商业品种，Malnoy等[32]于2016年利用DNA-free技术将纯化的CRISPR/Cas9核糖核酸蛋白和sgRNAs直接转入霞多丽葡萄(Chardonnay)的原生质体中对MLO-7进行突变。结果表明， Cas9与sgRNA含量比为3∶1时MLO-7基因的突变效率最高，而且没有产生额外的遗传修饰。这一过程不涉及任何外源DNA，在葡萄中建立了全程DNA-free基因编辑系统，使基因编辑植物与传统植物一样安全，此技术对于推动基因编辑植物的商业化利用具有重要意义。

木薯褐条病(CBSD)是由木薯褐条病毒(CBSV)和乌干达木薯褐条病毒(UCBSV)两种RNA病毒引起的，这两种病毒属于马铃薯Y病毒家族。该病害会导致木薯叶脉出现羽状缺绿，块根上出现黄色或褐色的软木状枯斑，严重影响木薯产量。研究表明，病毒基因组连接蛋白(VPg)需要与木薯翻译起始因子4E(eIF4E)亚型中的ncbp-1和ncbp-2进行相互作用才能引起褐条病毒的致病性。美国科研人员利用CRISPR/Cas9技术对木薯品种60444基因组中的ncbp-1和ncbp-2进行编辑，获得了ncbp-1、ncbp-2和ncbp-1/ncbp-2突变体。将突变型植株和野生型植株同时接种木薯褐条病毒，通过表型观察发现，ncbp-1/ncbp-2双突变植株的木薯褐条病的发病率明显降低，病害症状明显较弱。对获得的所有植物进行分析发现，91%的突变系在目标位点携带indels，其中纯合和双等位突变占78%。CRISPR/Cas9技术在木薯基因组中不仅实现了双基因突变，还获得了较高的编辑效率[33]。

3.2 抗旱性改良

干旱是因植物根部对叶片水分供应减少导致叶片水势以及膨压降低，严重影响植物正常生理功能和代谢机能，使生长受到抑制，甚至会引起部分或者整株死亡。据统计，全世界由于水分胁迫导致的作物减产可超过其他因素造成减产的总和，是世界上最为严重的灾害之一。我国52.5%的国土面积为干旱和半干旱地区，其中半干旱地区人工造林成活率、保存率仅为30%，而干旱地区仅为4%，最高不足20%，严重阻碍了林业生产的发展以及生态环境的改善[34]。杨树广泛分布于北半球，是我国重要的工业用材林和生态防护林树种，具有生长快、成材早、产量高等特点，但对干旱环境较为敏感，因此，耐旱基因型杨树的培育会进一步提高杨树产业的发展。林木在生长过程中，根系负责对水分和养分的吸收，木质部导管负责将水分养分运输到植株的各个部分。当植株受到干旱胁迫时，会通过两种机制确保植株逃逸干旱和耐受干旱。逃逸机制是通过增加根系生长促进植物对水分的吸收[35]。研究表明，拟南芥通过NF-YB2和NF-YC2与ABA响应元件进行互作来提高其对环境胁迫的抵抗能力。为了了解NF-Y在杨树逆境胁迫响应中的作用，利用CRISPR/Cas9系统介导获得了pdnf-yb21突变体材料，通过表型观察发现，与野生型相比，突变体的根系生长明显减弱，抗旱水平也明显下降，揭示了NF-Y转录因子在杨树抗旱中的功能[36]。当植物处于重度干旱的条件下，植物开始调节自身避免组织细胞死亡。此时，木质部细胞迅速感知干旱信号并将信号进行转导，激活bZIP类转录因子AREB/ABF，AREB/ABF通过与组蛋白乙酰化酶(GCN5)和转录共激活因子(ADA2)相互作用形成AREB-ADA2-GCN5蛋白复合体，与ABA应答基因的顺式作用元件ABRE进行结合，介导组蛋白3第9位赖氨酸的乙酰化(H3K9ac)修饰富集，诱导并促进ABA依赖基因的表达，最终提高植物对干旱胁迫的抵抗能力和耐受性。2019年Li等[37]以干旱条件下生长的毛果杨为研究材料，对其木质部进行染色质免疫共沉淀测序(ChIP-seq)绘制H3K9ac图谱，再结合转录组测序(RNA-seq)技术发现有76个含有ABRE元件的基因的启动子被H3K9ac修饰。他们采用RNA干扰技术对PtrAREB1-2、PtrGCN5-1的表达进行抑制，并通过CRISPR/Cas9技术对PtrADA2b-3进行敲除，3个基因突变植株的耐旱性均表现出明显降低，而且H3K9ac修饰和PtrNAC的转录水平也出现了显著下降，结果表明PtrAREB1-2、PtrADA2b-3和PtrGCN5-1均是激活杨树耐旱效应基因所必需的。由此可见，CRISPR/Cas9技术加速了杨树基因功能的研究进展，为林木抗旱分子育种技术奠定了理论基础。

4 问题与展望

木本植物具有世代周期长、遗传负荷高、基因组倍性复杂等生物学特点，利用传统育种方法选育良种时，周期很长、盲目性大，结果也不太理想，难以实现快速育种的目标。CRISPR系统以其操作简单、高效等优点，成为了继锌指核酸酶(ZFNs)技术和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)技术以来第3代定点编辑技术。利用CRISPR系统对木本植物基因组进行编辑，实现物种的原始创新，将大大加快木本植物的育种进程。但由于多数木本植物尚未建立稳定的遗传转化体系，限制了CRISPR系统的广泛应用。目前仅在杨树、山黄麻、木薯、柑橘、葡萄等少数物种中通过CRISPR/Cas9系统完成了靶标基因的定点突变，造成基因功能缺失，实现了相关基因功能验证，也获得了一些在生长、材性、抗性性状上得到改良的突变系。但CRISPR/Cas9系统在应用过程中也出现了一些问题，如：①脱靶效应，使基因组非靶向位点发生突变，降低了植物表型性状的可信性；②编辑效率普遍偏低，而且不同靶基因丧失功能的效率差异明显；③双等位基因突变体或纯合突变体少，绝大部分突变体为嵌合体。这些问题不仅与CRISPR/Cas9系统有关，也与木本植物基因组的特殊性相关。木本植物基因组大多经历了全基因组复制事件，导致基因组内存在大量的重复序列[38]，这些重复序列的存在会使sgRNA靶向多个序列，出现脱靶突变。另外，木本植物基因组的杂合度较高，等位基因间往往存在序列多态性，但目前这些已公布的基因组序列并没有等位基因的序列信息，当以其作为参考基因组设计sgRNA时，很可能会出现sgRNA靶向等位基因中的一个基因，导致嵌合体的产生。因此，高质量的基因组信息是提高CRISPR编辑效率并减少脱靶效应的重要因素，能够有效地对高杂合基因组生成高质量的单倍型基因组将会显著提高T0代双等位基因突变株或纯合突变株的比例。

如今，CRISPR已经发展成为以CRISPR/Cas9[39]、CRISPR/Cas12[40]、CRISPR/Cas13[41]和CRISPR/Cas14[42]为主的4大编辑系统。CRISPR/Cas12识别富含T的PAM序列，是CRISPR/Cas9的互补系统，这一系统只在柚子中得到了应用，获得的突变系表现出对柑橘溃疡病的抗性[23]。在今后的研究中应根据靶基因的PAM序列选择相应的编辑系统，提高木本植物基因编辑效率。另外，sgRNA可以同时靶向多个基因，甚至整个基因组序列，实现多基因同时敲除、全基因组突变体库构建，可进行木本植物冗余基因功能研究、基因调控研究及遗传育种[43-44]。木本植物还有很多性状是需要获得基因功能，如：植物的耐旱性，因此，利用CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12系统进行碱基替换或插入目的基因可实现基因的定向进化。该技术已成功应用在水稻(Oryzasativa)、小麦(Triticumaestivum)、玉米(Zeamays)[45]、西瓜(Citrulluslanatus)[46]、棉花(Gossypiumspp.)[47]等草本植物基因突变体的创制，均获得了碱基编辑新品种。目前，高彩霞研究组和李家洋研究组对Cas9进行了改造，构建了新型的饱和靶向内源基因突变碱基编辑器(STEME)，以水稻原生质体为材料进行编辑，结果显示一个sgRNA引导可以诱导靶位点C>T和A>G的同时突变， C>T突变效率高达61.61%，C>T和A>G同时发生突变的效率也高达15.50%，显著增加了靶基因碱基突变的饱和度及产生突变类型的多样性[48]。推进这一技术在木本植物中的应用，实现定向修正碱基突变和创制核苷酸变异，将加快木本植物基因功能获得性突变体的创制。虽然CRISPR系统为创建理想的突变体材料提供了可能，但该技术需要携带Cas9/Cas12-gRNA及转基因筛选标记的表达元件通过农杆菌介导法进入植物材料中，并整合到基因组上。由于木本植物营养生长周期较长，很难从突变系的后代中分离DNA-free和marker-free的基因编辑新品种，这将影响品种的审定与推广[49]。因此，建立全程DNA-free植物基因组编辑系统对于推动基因编辑植物的商业化利用具有重要意义。Malnoy等[32]利用DNA-free技术在葡萄的原生质体中对MLO-7基因进行了敲除，但效率极低，仅为0.1%，影响了该技术在木本植物中的应用。李正和教授研究组利用植物负链RNA弹状病毒载体向烟草叶片递送CRISPR/Cas9核酸内切酶，可有效形成系统侵染并表达Cas9/gRNA分子，对获得的再生植物进行基因分型，结果表明超过90%的植株含有靶向突变，其中纯和突变的概率高达57%[50]，远远超过了葡萄原生质体的转化效率，该研究为木本植物DNA-free基因组编辑的应用提供了新的思路。随着CRISPR技术的不断发展和完善，延伸了其在诸多研究中的应用，CRISPR/Cas13可以对RNA进行敲除及碱基替换，实现转录调控及RNA病毒的检测和捕杀[41]，CRISPR/Cas14可以对ssDNA病毒进行检测、捕杀及高保真SNP(single-nucleotide polymorphisms)基因分型[42]。还有一些基因组编辑的衍生技术，如dCas蛋白与不同功能蛋白形成的融合蛋白系统可进行基因转录调控、表观遗传调控、荧光成像等研究[51]，但这些研究在木本植物中的应用尚属空白，拓宽这些新技术在木本植物上的应用将会进一步加快木本植物基因功能研究及品种改良进程。