新型冠状病毒核酸检测的研究进展

曾绍妤

（北海市卫生学校附属医院，广西 北海，536000）

2019年12月湖北省武汉市报告一批不明原因肺炎聚集病例，随后经中国疾病预防控制中心调查[1]，依据病毒基因组序列和病毒分离结果，确认该病原体为一种新型冠状病毒。并归属为β冠状病毒，与2003年出现急性呼吸综合征相关冠状病毒、2012年中东呼吸综合征相关冠状病毒存在明显差异性，被命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2，相关疾病称之为2019 冠状病毒（COVID-19）[2]。对上述传播能力较大病原体，及时、准确实验室诊断为确定个体感染状态、妥善进行患者治疗及管理、调查病毒传播途径、控制进一步传播等诸多方面重要环节[3]。核酸检测方法具有高灵敏度、低假阳性率优势，相比较其他检测方式应用效果更佳。本文就新型冠状病毒核酸检测的研究进展如下阐述，具体如下。

1.测序技术

第二代基因测序技术可短时间内实现高通量的未知基因组测序。2019-nCoV 经患者呼吸道分泌物提取病毒ENA，构建cDNA 文库开展高通量测序，后续开展基因组比对分析确定新型冠状病毒。对其优势分析得出，可确定未知样本序列，疫情爆发初期阶段应用价值高。对高度疑似及逆转录聚合酶链式反应诊断阴性病例，测序技术可提升准确性，判断是否合并其他病原体。同时可用于判断病毒是否变异，以便改进检测手段[4]。但实际操作中，测序技术对仪器、人员要求高，检测时间长且费用高，不适用于人群大规模筛查。纳米孔靶向测序技术作为单分子实时测序技术，经DNA、RNA 生物纳米孔时产生电流变化开展碱性测序，配合小型实时测序设备，可用于即时检测[5]。纳米孔靶向测序技术灵敏度高于荧光定量PCR100 倍，检测范围广、成本低，反应速度快，可作为其他检测方法无效快速诊断选择。

2.PCR 技术

实时荧光定量PCR 归属为第二代PCR 技术，定量检测核酸。利用核酸扩增产生扩增曲线定量计算初始浓度，常见为荧光染料法、TaqMan 探针法。实时荧光定量PCR 作为WHO、中国国家卫生健康委员会等单位推荐新冠肺炎确诊标准之一。但大规模检测结果得出，实时荧光定量PCR 存在一定“假阴性”问题，阳性检出率仅为30%[6]。对其原因分析得出，与待测样本病毒载量低于常规实时荧光定量PCR 检出限，如何提高灵敏度成为需解决关键。微滴式数字PCR 相比较第二代，在绝对定量检测方面准确性、灵敏度显著偏高，在肿瘤突变基因检测、病原体检测等领域中发挥重要作用。相比较传统PCR 技术，微滴式数字PCR 每一条模板“单分子扩增”产生信号进行分析实现定量，可提高灵敏度[7]。且样本分散产生液滴越多，则体积越小，检出灵敏度越高。同时，与传统PCR 比较，微滴式数字PCR 对残留样本中蛋白、多糖抵抗作用更强，抑制作用削弱，相对检出率更高。

3.核酸等温扩增技术

核酸等温扩增技术无需热循环仪，扩增反应效率高、速度快，适用于病原体核酸的现场快速检测。因此，许多核酸等温扩增方法被用于2019-nCoV 检测[8]。依赖核酸序列的扩增技术（NASBA）可直接对RNA 靶标扩增等温扩增技术，利用含有T7启动子的逆转录引物将RNA靶标逆转录为含有T7启动子的cDNA，经T7 RNA 聚合酶对cDNA 进行转录扩增，得到大量RNA 扩增产物，合成RNA 扩增产物重新进入逆转录、转录扩增循环。在41℃进行，进入循环扩增反应前需在65℃进行引物退火。NASBA 可在1.5～2h 内将靶标扩增6～9 个数量级，灵敏度达到单拷贝/反应[9]。NASBA 技术作为DNA 靶标扩增，但DNA 靶标预变性过程会促使逆转录酶失活，仍需重新补加才可进行后续反应。且时间较长，流程复杂，多在实验室环境下进行RNA 检测。环介导等温扩增技术（LAMP）为2000年所提出一种核酸等温扩增技术，反应在60～65℃下，灵敏度达到10 拷贝/反应。有学者开发SARS-CoV-2 可视化检测方法，以钙黄绿素作为LAMP 扩增产物检测试剂，1h 内实现对20 拷贝/反应和200 拷贝/反应的SARS-CoV-2 基因组ORF 1ab 和S 基因靶标的检测。可实现多重病原体组和筛查，同时可利用肉眼观察颜色变化判读结果，降低对仪器设备要求，适用于资源有限及经济不发达地区开展核酸检测[10]。但经肉眼主观判断颜色变化存在较大个体主观判断差异，极易出现假阳性结果，使得上述检测方法准确性受到影响。

4.小结

检测技术从实验室至临床需经历四个阶段，概念认证阶段、少量样本分析阶段、大量患者参与临床实验阶段及技术商业化阶段。自疫情爆发以来，临床有关各式2019-nCoV 检测方法层出不穷，但目前多数停留在第二步少量样本分析阶段，尚未真正商业化运用。目前有关RT-PCR 方式被质疑准确性不佳，但血清免疫学检测无法用于低病毒载量、无症状感染者筛查，PCR技术发展，可提高灵敏度，但目前尚未作为商业应用。有关RT-PCR 核酸检测试剂盒能及时满足临床需要情况下，仍需考虑如何提高2019-nCoV 检测技术灵敏度，准确性及通量，实现全自动流水线式操作，满足临床筛查需求。