基因药物肺部递送系统的研究进展

李月，孙景鑫，金光玉，金勇，孙丹丹，全姬善

(1.延边大学药学院，吉林 延吉 133000；2.延边大学附属医院放射科，吉林 延吉 133000)

哮喘、肺气肿、囊性纤维化、肺部病毒感染、肺癌等肺部疾病严重影响人类健康，治疗方法在不断探索。基因药物针对遗传性疾病和非遗传性疾病的治疗中，体内外研究均显示出显著的治疗效果，被认为是当前最有前途的生物药物之一[1]。目前，基因治疗在肺部疾病的研究工作展开较多，这与肺部疾病发病率呈逐年上升的趋势且治疗难度日益增大，对人类健康产生了严重的威胁有关[2]。本文将对肺部常见疾病、肺部给药障碍以及给药方式进行详细综述。

1 肺部疾病

1.1 囊性纤维化 囊性纤维化是一种常染色体隐性遗传疾病[3]，该疾病会导致多种器官功能障碍，但是绝大多数患者死于肺部疾病[4]。囊性纤维化治疗中，腺相关病毒在多项临床实验中被证明是安全的、转染效率高的载体。现在面临的问题有：具有功能性囊性纤维化跨膜电导调节剂的气道表面细胞寿命有限，需要重复进行给药；囊性纤维化患者的气管和肺部环境在非灵长类动物模型无法建立；基因治疗时选择短期免疫抑制剂未在囊性纤维化患者进行测试，因此无法证明其可行性[5]。

1.2 哮喘 哮喘是常见的呼吸道疾病，儿童中最常见的非传染性疾病。近年来，随着社会环境和生活方式的改变，发病率有逐年升高的趋势[6]。随着对哮喘发病机制的进一步认识，哮喘已被确定为一种由多种炎性细胞所介导的慢性呼吸道炎症性疾病[7]。当前治疗哮喘最有效的方法为糖皮质激素类抗炎药物，如 β2受体激动剂联合茶碱类药物治疗、重组抗IgE人源化单克隆抗体。Norbert等[8]对一种新型mRNA进行临床实验评估，结果显示生物标志物样本中炎症反应减弱，过敏性哮喘患者在过敏原激发后的哮喘反应显著减弱。基因治疗多采用DNA 重组技术，修复细胞中的缺陷基因，达到治疗目的，虽然在治疗哮喘领域的应用刚刚起步，但其革命性的治疗理念为患者带来新的希望而成为当前研究的热点。

1.3 病毒感染 由病毒感染所引起的各种疾病严重威胁人类健康。肺部作为易受感染的部位之一，经常出现由上呼吸道感染引起的病毒性炎症。特定序列的 siRNA能降解目标病毒RNA 或抑制宿主细胞目的基因的表达而影响病毒的复制，已被用作抗病毒剂在抵抗SARS 病毒、流感病毒等肺部感染方面取得了初步进展[9]。裸siRNA在给药方面有很多阻碍[10]，经大量实验证实[11]，安全有效的纳米载体可有效递送siRNA，这为进一步开发预防和治疗人和动物流感病毒感染的siRNA提供了依据[12]。

1.4 肺癌 肺癌是我国首位的致死性恶性肿瘤，其发生、发展和转移是一个极其复杂的多基因调控异常的过程[13]。在过去的20年中，治疗重心已经从以细胞毒性治疗转变为以肺腺癌和非小细胞肺癌中特定分子亚型为靶点如EGFR、KRAS等[14]，通过核酸递送来达到治愈疾病的目的[15]。当前，腺病毒载体和非病毒基因递送载体在临床试验中均显示出良好的成效[16-19]。

2 肺部给药屏障

2.1 肺部生理结构 肺由大量肺泡组成，肺泡呈薄膜状，由单层上皮细胞构成，是气体交换的唯一场所。肺是人体毛细血管最丰富的器官。90%的肺泡面积都覆盖毛细血管，成人毛细血管面积可达80 m2。相邻肺泡的两层上皮细胞膜之间分布着致密的毛细血管，而且毛细血管的上皮细胞膜与肺泡的上皮细胞膜是紧紧贴在一起，有利于药物经肺部的吸收和转运[20]。从右心搏出的血液几乎全部通过肺，肺部血流量大，因此肺给药后药物吸收迅速；药物经肺吸收后直接进入血液循环，避免肝首过效应，提高生物利用度；肺内的化学降解和酶降解活性低，适合生物活性大分子，如蛋白、核酸类药物[21]。

2.2 药物递送肺部的障碍 由于肺部具有吸收面积大，降解酶少，肺泡通透性高，物质交换距离短等优点，蛋白质和多肽也可通过肺泡表面被吸收[22]，将治疗性药物直接递送到肺部病灶部位发挥治疗作用将具有一定的优越性。在临床治疗中治疗效果受到多种因素的影响，包括肺部药物递送方面，面临障碍如下：①气道黏液纤毛清除系统：作为肺部最重要的防御机制之一，通过咳嗽等方式将传导气管中沉积的物质清除，健康的肺部仅需24 h即可完全清除沉积物，这对肺部药物递送是不利的；②病理状态：病理状态下，气道黏液清除能力减弱；肺部气道因哮喘等疾病导致狭窄，影响药物的运输和吸收；③化学屏障和免疫屏障：沉积药物会在蛋白酶或表面活性剂等化学物质的作用下，被肺泡巨噬细胞吞噬清除[24]；④其他障碍：吸入剂的剂型、吸入器的选择以及患者依从性等。

3 基因治疗以及常见载体

基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞，以达到纠正或补偿免疫缺陷和异常基因引起的疾病的目的[23]。基因疗法于1972 年被正式提出，并作为人类遗传疾病的一种治疗方式[24]。随着分子生物学、动物模型构建、疾病靶向治疗等研究领域的不断发展，基因治疗广泛地应用于肿瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、基因遗传病等疾病的治疗[25]。

肺部是采用基因疗法治疗遗传性疾病如囊性纤维化、α1-抗胰蛋白酶缺乏症以及其他疾病如肺癌、肺炎、肺血管疾病、哮喘的主要靶向器官[26]。疾病治疗的关键在于将基因药物成功递送到肺部，所以需要安全有效的基因载体。当前基因载体主要分为病毒载体和非病毒载体。在肺部基因治疗中，无复制能力的重组腺病毒因具有较高的转染效率使用最为广泛，但其具有毒性和可引起局部或全身的免疫反应和炎症反应限制了应用[27]。非病毒基因载体因其具有低免疫原性和无毒的特征受到了广泛的关注，目前研究较多的非病毒肺部给药载体主要有微球、聚合物纳米粒、 脂质体、固体脂质纳米粒、纳米脂质载体、胶束等[28]，并且在一定程度上这些载体属于缓控释制剂，可以延长药物作用时间，减少服药频率，提高患者依从性。

4 基因药物肺部给药系统

肺部给药系统是药物经特殊给药装置直接进入呼吸道发挥局部或全身治疗作用的给药系统[29]。肺部给药在肺部局部疾病的治疗、全身性的治疗以及基因治疗中极具发展前景，是蛋白质和多肽等非注射性药物和其他治疗性药物较为方便有效的给药途径[30]。药物能否被成功递送到肺部有两个重要的决定性因素：处方设计和给药方式的选择。

4.1 药物处方设计 传统的肺部给药制剂存在药效时间相对短、给药次数多、患者依从性较差等缺点，开发具有缓控释能力的新型肺部药物传递系统从而实现肺部靶向性给药，增加药物在肺部的滞留时间，增加细胞内的药物浓度，降低治疗过程中对正常组织细胞的损伤，使难溶性药物、蛋白质与多肽类药物的生物利用度达到最大是当前研究的重点[31]。非病毒基因载体如阳离子脂质体、阳离子聚合物等不仅可以保护基因药物免受破坏，还可以通过对载体进行修饰实现功能化的药物递送，所以非病毒基因载体受到了科研人员的广泛关注。

影响药物能否成功递送到肺部的因素如下：肺吸入微粒的粒径直接影响其在肺部的沉积形式和部位。粒径>5.0 μm的颗粒会产生惯性碰击在咽喉和上呼吸道；粒径<5.0 μm的颗粒可以到达肺泡区，以补充作用和弥散作用沉积在肺泡表面[32]；粒径在1.0～5.0 μm的粒子主要以重力沉积形式到达呼吸道深部，沉积在气管和肺泡表面；粒径<0.5 μm的粒子由于布朗运动随气流呼出体外，通常80%被排出，基本不在呼吸道沉积。粒径在1.0～3.0 μm的粒子在细支气管和肺泡内沉积率最高，一般被选作肺吸入制剂的主要组成[22]。直径小于2 μm的颗粒物进入肺泡后，可被肺巨噬细胞吞噬，转染前清除肺巨噬细胞，转染效率可提高90%[32]。

基因载体的修饰材料直接影响药物的稳定性。据报道[33]，雾化过程剪切力对基因药物会造成破坏，阳离子脂质体和阳离子聚合物会保护基因药物，提高对剪切力的耐受性。多种不同组分的阳离子脂质体可以增加稳定性从而提高转染效率。阳离子聚合物如聚乙烯亚胺和聚乙二醇可以有效地保护基因药物免受破坏[34]，复合物的稳定性取决于聚合物的分子量[35]。另外，在处方中加入适当氯化钠也可提高复合物的稳定性[36]。

4.2 肺部给药方式

4.2.1 常规给药途径 静脉注射给药，也称为全身递送，是当前基因治疗普遍采用的给药方法。Hattori等[37]以基于DOTAP的脂质体作为载体通过静脉注射的方式将siRNA递送到MCF-7-Luc肺癌细胞转移的异种移植小鼠中，可观察到siRNA主要在肺中积累。然而有报道指出[38]，注射给药递送到的是肺部内皮细胞而不是上皮细胞，基因药物容易被肾脏清除，肺内分布较少。

4.2.2 吸入给药方式 目前，通过吸入给药进行基因治疗已被认为是肺部疾病最有希望的治疗方法之一，特别是在肺癌治疗中[39]。相较常规制剂，吸入剂的优点在于：可以从肺部直接进入血液循环，起效快；局部给药，提高药物在靶器官的聚集，增加疗效的同时降低毒副作用；无首过效应，生物利用度高[20]。采用吸入给药的方式多分为以下几种：

4.2.2.1 经鼻腔给药 鼻内给药是将药物用移液枪或注射器少量滴注在小鼠鼻孔处，该方法只适用于小剂量的基因治疗给药。因鼻黏膜血管丰富，所以经鼻腔给药具有药物吸收快，生物利用度高的优点；但是，经鼻腔给药后，药物大部分在口腔和鼻腔以及上呼吸道内，且分布不均匀易流失，无法到达下呼吸道和肺部。

4.2.2.2 气管内给药 气管插管给药是将实验动物麻醉后，剥离气管，将导管切口插入气管，在动物吸气时用注射器将药物喷入气管中。气管插管给药是在动物模型实验中评价药物肺部给药最常见的一种方法[9]。该方法可对药物进行定量评价，但是具有如下缺点：动物麻醉剂量难以掌握；术后动物无法存活，不能重复给药。

气管喷入或滴注给药，是将给药针插入气管中，使药物喷射或滴注到气管中的一种给药方法。气管内滴注给药时，动物仰卧姿势、滴注装置和滴注速度对药物在肺部的分布有重要的影响：Hasegawa-Baba等[40]证实大鼠在仰卧45°时可避免药物在气管中堵塞，药物分布良好，动物存活率高；与灌胃针等相比较，使用干粉喷雾肺部给药装置MicroSprayer Aerosolizer进行滴注时，药物能更好地分布在肺部；滴注速度为慢速时，药物悬浮液不能均匀的分散到肺中，而高速滴注具有良好的药物分布。气管喷入或滴注给药可以多次重复给药，可对药物进行定量。气管滴注不能成为测定药物分布的实验方法，原因如下：需要用到小动物喉镜，MicroSprayer设备停产；大量滴注时药物进入胃中；气管滴注可导致肺部巨噬细胞数量增多，引起炎症反应[41]。最近，Oiso等[42]提出采用负压法将药物递送到肺部，并对该方法进行评估，发现对肺组织无伤害，该方法中药物递送量是由小鼠呼吸控制；此外，在弹性蛋白酶诱导的肺气肿小鼠模型中使用可再生塌陷肺泡的药物实验结果表明，负压方法对肺组织学具有显著的治疗作用。

4.2.2.3 雾化吸入给药 雾化吸入给药，是将动物置于密闭装置中，使其被动吸入药物，是模拟人吸入药物的一种实验方法。人可以进行主动呼吸将药物吸收到肺，但是动物实验中无法控制其吸入的药物量。动物吸入药物时，不仅会有药物分散到动物的鼻腔、皮毛和装置内部表面上，造成药物的浪费，而且在吸入药物前没有将肺部气体呼出，吸入后没有足够的时间停顿屏气[24]，导致药物也无法到达肺深部[23]。另外，药物能否到达动物肺部依赖于雾化设备[38]，常见的雾化设备有静电喷射式雾化机、机械振荡雾化机、超声雾化机及喷射式雾化机[42-44]。喷射雾化器的负载剂量与雾化剂量之间存在一定的差异，药物在肺部的沉积少，造成了药物的浪费；超声雾化器可以调节雾化速度和雾滴大小，但是雾化时间长；机械振荡雾化机为新一代雾化机，使用尚未普及，且价格昂贵，使用振动网筛雾化器Aerogen Ultra时，肺部剂量仅为负载剂量的34%，造成了大部分药物的浪费；静电喷射式雾化机例如AERx，可成功地将基因递送到肺部，但目前AERx尚处于实验室研发阶段。

5 总结

通过基因治疗的方式来治疗肺部疾病是一种有前景的治疗方法，目前肺部吸入给药在干粉吸入剂、给药装置等方面取得可喜的成果，但肺部给药的临床治疗效果易受药物性质、剂型因素、给药装置和使用方法等众多因素的影响。当前我们需要研发出更有利于基因转染和产生更小颗粒的雾化器，实现药物的大规模精准递送，以及具有深层组织渗透能力的基因载体[30]。非病毒基因载体脂质聚合物作为一种新型药物递送系统，因制备简单、毒性低而备受关注[45]，当前缺乏大量的动物实验和体内数据的支撑，并且在安全性和稳定性方面还需要继续考察，这将成为今后科研工作者的研究重点。