液体活检在肺癌诊治中的应用和挑战

吴珍 赵微 戴钰 陈良安

解放军总医院第一医学中心呼吸与危重症医学科，北京100853

肺癌作为病死率最高的恶性肿瘤[1]，极大地危害了人类的健康和影响了社会经济的发展。肺癌传统的诊断手段以组织病理活检为金标准，但由于肿瘤异质性、患者自身不耐受等原因使得组织活检在临床应用中具有一定的局限性。液体活检则能较好地弥补上述不足，从早期筛查到指导个体化诊疗，应用广泛且意义重大。

一、液体活检的发展史

液体活检指应用来源于人体循环的体液样本进行疾病相关分子的检测来指导疾病的诊疗，其不仅用于肿瘤疾病的辅助诊疗，还在产前诊断、心血管疾病、慢性肾病、脑卒中等疾病的诊治中发挥重要作用[2-5]。在肿瘤的液体活检中应用最广泛的为循环游离DNA (cell free DNA，cf DNA)。cf DNA由Mandel和Metais于1948年发现并报道，是一种存在于人体体液中且游离于细胞之外的核酸，主要由凋亡或坏死细胞释放而成[6]。而后，肿瘤患者外周血中被证实含有更多的cf DNA。1994 年，Vasioukhin等[7]在肿瘤患者cf DNA 中发现了肿瘤相关的RAS基因突变。这部分含有肿瘤相关突变的cf DNA 称为循环肿瘤DNA (circulating t u mor DNA，ct DNA)，来源于凋亡或坏死的肿瘤细胞释放、循环肿瘤细胞 (circulating tu mor cell，CTC)或外泌体等[8]。随后更多的研究发现ct DNA 可反映肿瘤组织基因组变异和表观遗传学等改变，进一步提升了液体活检在肿瘤诊疗领域的应用与进展[9-10]。

CTC是另一种常见的液体活检技术，1869年由Ash wort h发现肿瘤患者外周血中存在与肿瘤细胞相似的细胞，提出了CTC的概念[11]。直到2003年，CTC才被完全定义：一方面为来源于原发灶或转移灶的肿瘤细胞通过毛细血管入侵血液循环系统进入血管形成，另一方面为肿瘤细胞获得间质上皮转化使得细胞的侵袭能力增强入侵基底膜而形成[12]。随着单细胞测序技术的发展，CTC 所具有的基因组信息被深入挖掘，被证实与肿瘤原发灶和转移灶存在相似的基因谱，其在肿瘤疾病诊治中的作用越来越突出，有望成为补充和替代肿瘤组织的体液样本。且CTC 获取方便，可实现动态监测，有助于肿瘤诊疗过程中的个体化动态指导[13-14]。

二、液体活检在肺癌诊治中的应用

液体活检以其安全、无创和可重复检测的优势广泛应用于肺癌临床诊疗，为肺癌的早诊提供了安全有效的方法，给不能耐受组织活检的患者提供了靶点检测的机会，对治疗过程中的随访和监测也提供了一定的便利，并且减少了耐药后不必要的再活检，贯穿于肺癌患者的全程诊疗过程。

(一)肺癌患者的早期诊断

大多数肺癌患者早期时无明显症状，且目前缺乏有效的早期诊断方法，使得多数患者确诊时已处于晚期。尽管美国国立卫生研究院于2011年发表研究结果证实低剂量CT 筛查可以降低20%的肺癌病死率以及6.7%的总死亡率，但是低剂量CT中高达96.4%的假阳性率导致不必要的过度医疗和辐射暴露[15]。液体活检技术通过对其中cf DNA、微小RNA (micro RNA，mi RNA)、CTC 和肿瘤血小板进行检测可实现肺癌的早期诊断，有望成为将来肺癌早诊的又一大策略。早在20世纪，研究中就发现肿瘤患者外周血中的cf DNA 含量比普通健康者更多[16]。Chabon 等[17]利用深度测序的方法，再结合机器学习，将早期肺癌患者血浆中的cf DNA 与风险匹配对照组血浆中的cf DNA 进行差异分析，前瞻性地建立并验证了一种称为“血浆中肺癌可能性” (Lung-CLi P)的机器学习方法用于早期肺癌的筛查。研究者们从TCGA 数据库中筛选出3个与肺癌相关性高的mi RNA：mi R-21-5p、mi R-103-3p、mi R-126-3p，联合这3个mi RNA 在肺结节患者中进行肺癌筛查的敏感度可达到81.2%，而与胸部CT 联合诊断可使得肺癌早诊的敏感度上升到89.9%[18]。对mi RNA 的联合应用还可进一步区分早期肺癌的病理分型，Lu等[19]研究表明应用3 个mi RNA 分子 (mi R-17、mi R-190b、mi R-375)可区分小细胞肺癌与非小细胞肺癌，敏感度和特异度可分别达到82%和84%。肺癌特异性抗体联合胸部CT 进行肺癌早期筛查的阳性预测值可达95%，高于单独应用胸部CT(69%)或特异性抗体 (85.2%)的阳性预测值[20]。借助于液体活检，能够以更加安全、易于接受的方法提高肺癌早诊的普及性，并且与目前已有的影像学筛查结合具有更高的敏感度，可进一步提高肺癌早诊的阳性率，做到早发现、早治疗，进而改善肺癌患者的整体生存质量，并延长生存期。

(二)肺癌患者的靶点检测

目前指南推荐非小细胞肺癌确诊后应首先进行驱动基因检测以明确下一步治疗方案[21]。尽管靶点检测的金标准仍是组织分子检测，但由于患者身体的耐受性以及肿瘤异质性导致的单次活检的局限性使得组织活检在临床的应用受限[10，22-23]。采用全身外周体液中的cf DNA、CTC、外泌体、TEP 等进行分子靶点的检测，以安全简便、易于动态监测的特点广泛应用于临床以指导个体化精准诊疗。从Bai等[24]用高性能液相质谱检测外周血ct DNA 中EGFR 突变，到后来实时荧光定量PCR 的应用，液体活检在非小细胞肺癌患者靶点检测中的应用越来越广泛。而基于荧光定量PCR 平台的Cobas检测技术被美国食品药品监督管理局批准用于液体活检检测EGFR 已知突变位点 (19 外显子缺失、L858 R 点突变和T790 M 突变)[25]。随着检测技术的不断发展，使得液体活检在分子检测中的敏感度能够进一步提升，更好地满足临床诊疗需求。目前二代测序进行液体活检在驱动基因检测中的一致性可以达到90%以上，且转移灶数目越多的患者血浆检测驱动基因的敏感度和一致性越高[26-27]。目前液体活检所覆盖的分子谱也越来越广泛，既满足了非小细胞肺癌临床诊疗中的常见分子靶点EGFR和ALK 等基因的检出，也能发现更多驱动基因的未知位点，还能进一步进行耐药机制的深入探讨[28-30]。

(三)肺癌患者的耐药监测

耐药是肺癌患者治疗过程中不可避免的结局。耐药后的分子检测仍然以组织检测为金标准。由于多数患者耐药后身体状况无法耐受有创的耐药后再活检，使得多数患者在耐药后失去进行分子检测的机会。安全微创的液体活检再次解决了这一难题。研究发现，与组织样本相比，耐药患者血浆样本检出T790 M 的一致性可达70%以上，且胸腔外转移患者血浆检出T790 M 突变的阳性率更高[31-32]。一代EGFR-TKI耐药患者的血浆中能够早于影像学进展2个月检出T790 M 的存在，有助于患者的耐药监测，以便尽早发现耐药[33]。由于肿瘤的异质性导致单次组织活检检出的耐药基因谱不全，而来自外周循环的体液样本同时包含了肿瘤原发灶和转移灶的肿瘤分子背景，能够较全面地检出耐药基因谱[34]。Tho mpson等[35]研究表明耐药患者外周血能检测到肿瘤组织无法检出的T790 M 耐药突变，进一步为耐药患者提供有效的治疗方案。液体活检再次为耐药患者提供了安全便利的分子检测方法，不仅有助于检出耐药基因，还能早于临床影像学评估就监测到耐药的出现，并且还能弥补肿瘤组织异质性导致的肿瘤耐药谱不全，更好地指导耐药患者的后续治疗。

(四)肺癌患者的预后评估

越来越多的研究还证实利用液体活检进行疾病监测，可以评估和预测患者的预后。在早期肺癌患者术后，外周血中检测ct DNA 或CTC阳性组的患者术后1年复发率和术后2年复发率均高于阴性组[36]。TRACERx研究纳入了100 例早期肺癌术后的患者通过ct DNA 来监测驱动基因数目的变化，结果表明，以ct DNA 监测驱动基因数目大于等于2个作为复发的标志，其敏感度和特异度可达到93%和90%，并且可早于影像学进展之前预测复发的出现[37-39]。液体活检对靶向治疗的预后同样具有一定作用，BENEFIT 研究证实血浆检测EGFR突变阳性患者接受一代EGFR-TKI的客观缓解率为72.1%，中位无进展生存期为9.5个月。同时在接受治疗后的第8周，血浆EGFR 转阴的患者可获得更长的无进展生存期[40]。初治时EGFR 突变的频率也被认为与一代EGFR-TKI治疗的预后相关：突变频率大于5.15%的患者接受一代EGFRTKI治疗获得的无进展生存期长于EGFR 突变频率小于5.15%的患者 (15.4个月比11.1个月)[41]。血浆中ALK 突变频率的动态变化同样可以评估ALK 抑制剂的疗效[28]，动态监测BRAF突变频率的降低也可提示相关的靶向治疗有效[42]。

三、液体活检在肺癌诊治中的挑战

(一)检测样本的选择

作为临床检测最常见的标本之一，外周血样本是最早应用于肺癌患者液体活检的样本，其获取方便，检测敏感度高，在肺癌诊疗中的应用也最为广泛。但是，研究者发现，来自于多数肺癌患者外周血中的ct DNA 量占总体cf DNA 的比值小于1%，且受肿瘤分期、患者病灶部位、肿瘤负荷等因素影响而使外周血ct DNA 检测存在一定的局限性[43-45]。近些年来，除外周血以外的其他样本也逐渐被用于肺癌患者的液体活检中。痰液样本作为呼吸系统疾病最常见的标本之一，其中含有大量的cf DNA[46]。研究证实，肺癌患者cf DNA 可以用于驱动基因检测，尽管在驱动基因检测中的一致性不如外周血，但是其可以检测到外周血无法检测到的基因突变，两者联合可以检测到更多的肿瘤分子靶点，且吸烟患者的痰液cf DNA 检测驱动基因的一致性高于非吸烟患者[47]。基于尿液样本的液体活检也被证实与组织样本具有较好的一致性[48]，与血液样本的联合可以检出更多的驱动基因变异[49]。尿液样本cf DNA 进行T790 M 的动态监测还可以评估奥希替尼的早期疗效[50]。胸腔积液作为肺癌患者的常见标本之一，在检测驱动基因中的价值较外周血更胜一筹。胸腔积液上清液中的cf DNA 检测到的肿瘤突变负荷 (tu mor mutation bur den，T MB)与肿瘤组织中检测到的T MB相似，高于外周血cf DNA检测到的T MB。在检出的EGFR 突变频率比较中也是胸腔积液cf DNA 高于外周血cf DNA[51]。而脑脊液在肺癌脑转移患者驱动基因检测中的敏感度和一致性也要高于外周血样本，并且脑脊液cf DNA能够检出更多的驱动基因拷贝数变异[52]。越来越多的体液样本用于液体活检，在样本选择中我们应该根据患者临床特点和疾病特征，结合标本获取的可行性来有针对性的选择最适合的样本，提高液体活检在肺癌诊疗中的应用价值。

(二)检测成分的取舍

大量研究表明cf DNA 是液体活检中应用最多的生物标志物，其次是CTC。CTC 来源于原发或转移灶并具有通过循环系统传播到远处形成转移灶的潜能，携带肿瘤相关分子谱，可以用于肿瘤诊断和评估预后。与健康对照组相比，早期肺癌患者外周血中能检测到一定数目的CTC[53]。利用二代测序技术可以进行CTC 全基因组扩增测序或单细胞全外显子测序，了解肿瘤特异性的分子变异，评估耐药和分析表型转化[13]。另外，CTC 在融合基因检测中更具优势。利用CTC 中的RNA 测序进行ALK 等融合基因变异检测，与组织分子检测相比具有较高的一致性，并且能够根据其动态变化预测ALK 抑制剂的疗效[54]。但CTC 由于其在外周血中的稀缺性、CTC表型的变异性以及单个CTC 下游分子分析的局限性，使得其在临床中的应用有待进一步提高和改善[55]。外泌体是一种具有脂质双层膜结构的微小囊泡，其在肿瘤患者外周体液中含量丰富，其内含有大量的核酸分子，由于外泌体表层的脂膜结构使得包含其中的DNA 和RNA 较cf DNA 更加稳定，且外泌体由活细胞分泌，具有很好的肿瘤特征代表性[56]。二代测序检测外泌体DNA 中的驱动基因变异，可达到95%的敏感度，并且外泌体DNA 中所检测的驱动基因频率还可进一步指导肺癌患者的预后[26]。应用外泌体中的DNA 和RNA 分子进行T790 M 耐药检测，可获得92%的敏感度，而传统的液体活检应用ct DNA 检测T790 M 突变的敏感度仅为58%。应用外泌体核酸可以使得一代EGFR-TKI耐药患者不必要的再活检率从42%下降到8%[57]。但目前外泌体的获取和鉴定方法尚无统一标准，其临床应用有待进一步验证和推广[58]。除此之外，循环RNA 和肿瘤教育血小板在肺癌早期诊断中也有一定的价值，为肺癌患者的液体活检提供了更多的选择方式[59-60]。

(三)检测方法的权衡

目前多种方法用于液体活检，基于荧光定量PCR 平台的Cobas、数字PCR 和二代测序是常见的3种检测方法。Cobas是目前美国食品药品监督管理局批准用于临床患者液体活检的检测方法，其检测周期短，成本低，覆盖EGFR 基因的临床常见和已知位点，但是多中心的研究显示其敏感度只有72.1%[61]。数字PCR 是一种绝对定量方法，其敏感度高于普通PCR[62]，且检测阈值能覆盖低频突变位点，对于肺癌患者治疗过程中已知靶点的动态监测意义显著，有助于治疗过程中的疗效预测和耐药监测[33]。二代测序是一种高通量测序方法，可一次检测包括点突变、缺失、融合、拷贝数变异等多个基因的多种已知和未知变异类型，节约样本，一次检测覆盖所有待检测的基因[63]，尤其对耐药基因的探索有重要意义，且具有较高的敏感度[64]，但检测周期往往需要1～2周，价格成本较昂贵。针对不同患者的临床需求，应选择不同的检测方法使液体活检更好地服务临床，指导患者的精准诊疗。

(四)免疫治疗中的应用价值

免疫治疗是肺癌诊治领域继靶向治疗后又一里程碑式的进展，给许多肺癌患者带来新的希望。在免疫治疗获益人群的挑选上，NCCN 指南依然推荐 在PD-L1 阳 性 且 EGFR、ALK、ROS1 和BRAF阴性或突变状态未知的晚期非小细胞肺癌患者使用免疫治疗[21]。PD-L1 表达以组织检测为金标准，但部分晚期患者由于不能耐受组织活检而无法进行PD-L1 表达的检测。研究者发现外周血CTC同样可以用于PD-L1表达的检测，并且能够进行免疫治疗的疗效预测，但是其与组织PD-L1表达的一致性有待进一步提高[65]。除PD-L1表达以外，T MB是免疫治疗另一热门标志物[66]，利用外周血进行T MB可以通过界定阈值实现免疫治疗的疗效评估[67]。但无论是组织检出还是液体活检，目前对于T MB的检测标准仍然没有统一定论。微卫星不稳定性检测也为实体瘤免疫治疗的疗效评估提供了一定的依据[68]，液体活检同样为其检测带来了新的途径，并且经外周血检测的微卫星不稳定性与组织相比具有98.4%的一致性[69]。

毫无疑问，液体活检为肺癌患者的诊治提供了有力帮助，让更多的患者从中获益。基于检测技术的不断进展，液体活检在靶点检测中已经与组织分子检测有很好的一致性，为后续治疗过程中的动态监测和耐药检测打下了坚实的基础。作为一项新兴技术，液体活检仍然存在一定的挑战。外周循环中ct DNA、CTC等物质的量和稳定性受肿瘤分期和肿瘤负荷的影响，会影响液体活检在临床应用中的敏感性。CTC、外泌体的分离和获取也是限制其临床应用的重要因素。另外，如何更好地利用液体活检辅助免疫治疗也是其未来的发展方向。借助于科学技术的不断进展，未来液体活检必将以其安全、便捷的优势更好地应用于肺癌患者的临床诊疗实践。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突