CTCs监测肿瘤转移机制及在结直肠癌诊疗中的应用

程煌荣，郑勇斌

(武汉大学人民医院胃肠外科，武汉 430060)

近年来，随着国民健康体检意识的提高以及临床诊疗技术的发展，许多早期肿瘤患者得到有效诊治。据统计，2017年全球恶性肿瘤的致死病例高达2.335亿，其中结直肠癌899.6万例，位居第二[1]。肿瘤发生远处转移是晚期肿瘤患者致死的主要原因，约90%的患者死于肿瘤转移，因此明确肿瘤远处转移的机制是改善肿瘤患者预后的关键[2]。学者们不断尝试着对肿瘤转移的机制提出猜想并予以验证，如最初的种子-土壤学说以及随后陆续提出的转移瀑布学说、肿瘤干细胞理论、细胞挤出假说等，但目前仍无公认统一的解释。随着细胞分离、采集和基因测序等技术的成熟，液体活检在肿瘤领域被广泛应用，作为液体活检主要检测对象之一的循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)在乳腺癌、结直肠癌等肿瘤临床应用中显示出巨大价值，因此CTCs与肿瘤转移的潜在联系成为研究的热点。现通过分析肿瘤转移的一系列过程、CTCs的上皮-间充质转化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)、血小板和肿瘤微环境对CTCs形成、存活、转移的调控，对CTCs在肿瘤远处转移中的作用机制研究进展予以综述，探讨CTCs在肿瘤血行转移中可能的作用机制以及对结直肠癌的临床指导作用，以期为肿瘤转移的进一步研究和结直肠癌诊疗提供参考依据。

1 CTCs和肿瘤血行转移

CTCs指从原发肿瘤或转移灶自发或被动地脱落后侵袭血管并进入血液循环，逃离宿主免疫杀伤后在远处部位形成病变的肿瘤细胞[3]。CTCs在外周血中非常稀有，每10亿个正常血细胞才可能发现1个CTCs，稀有性限制了CTCs在临床上的应用[4]。近年来，由于细胞富集技术敏感性的提升，CTCs在肿瘤领域的相关研究不断涌现，Cristofanilli等[5]通过研究乳腺癌患者外周血CTCs水平，首次提出CTCs可能是恶性肿瘤患者无进展生存期与总生存期的有效标志物。Sastre等[6]对127例试验对象进行CTCs检测发现，入组结直肠癌患者的CTCs阳性率为36.2%，与肿瘤的临床分期显著相关(Ⅱ期为20.7%、Ⅲ期为24.1%、Ⅳ期为60.7%，P<0.005)。随后研究表明，CTCs检测可以评估肿瘤患者转移和复发风险[7]，美国临床肿瘤协会将CTCs纳入新型肿瘤标志物，美国癌症联合委员会也将其纳入乳腺癌TNM分期系统中。CTCs在肿瘤早期诊断、疗效监测、预后评估方面的潜在价值，促使研究者更加关注CTCs导致肿瘤转移的机制。

CTCs以血液为“载体”，并以血行转移方式向远处播散，大致过程如下：①局部浸润与血管内渗：肿瘤细胞从原发病灶脱落，突破肿瘤周围组织、降解基质、穿过血管基膜，进入血管；②迁移：肿瘤细胞进入体内循环系统后逃避免疫监视，以CTCs的形式运输至全身；③播散肿瘤细胞形成：停留在毛细血管床的CTCs与血管内皮细胞相黏附，穿过血管壁进入组织或器官，成为播散肿瘤细胞；④定植、增殖形成转移灶：播散肿瘤细胞在转移部位增殖形成转移灶；⑤转移灶的二次转移：“迁移”是肿瘤在远处转移过程中的关键环节，CTCs通过细胞黏附分子黏附于血管内皮是迁移机制的基础。然而，目前CTCs参与肿瘤转移的具体机制尚未完全阐明。

2 CTCs在肿瘤转移过程中的机制

2.1EMT的促肿瘤细胞转移作用 EMT是肿瘤转移性生长的必要条件。第一，EMT过程是肿瘤细胞表型变化和转移级联所必需的。多种生长因子(如表皮生长因子、转化生长因子-β)、细胞因子和转录因子(如锌指蛋白转录因子、锌指E-box结合同源框1和2、转录因子4、叉头框蛋白C2)的活性在肿瘤恶性进展过程中失调，肿瘤细胞表型从上皮表型转变为间充质表型，表现为上皮蛋白(闭合蛋白、细胞角蛋白、上皮钙黏素等)下调、间充质蛋白(纤维连接蛋白、波形蛋白、神经钙黏素等)上调、apico-基底极性以及细胞肌动蛋白骨架重塑等，这些变化使得紧密的细胞间连接(黏着连接、桥粒连接)被点连接代替甚至失去连接，丢失细胞间的黏附作用和上皮极性。在赋予肿瘤细胞干细胞特性同时，促进肿瘤细胞穿过组织间质向血管内渗成为CTCs，增加肿瘤细胞活动迁移的能力[8]。第二，EMT促进循环系统中CTCs的存活。诱导EMT的转录因子(如锌指蛋白转录因子)一方面可促进肿瘤细胞产生侵袭性伪足，通过局部蛋白酶的蓄积以侵入细胞外基质，另一方面可以通过干扰正常的凋亡联级抵抗衰老，保护CTCs免于失巢凋亡[9]。此外，还可以使CTCs对放疗和化疗产生耐药性，从而有助于肿瘤细胞扩散、进一步提高CTCs的存活能力并在远处形成增殖灶[10]。第三，EMT过程可逆。EMT发挥作用的信号通路大多数最终作用于上皮钙黏素的表达调控[8]。当钙黏素重新激活时可触发EMT的逆过程：间充质-上皮转化使肿瘤细胞恢复上皮表型，有助于肿瘤细胞在新的宿主微环境中存活，并获得增殖和肿瘤转移的能力[8]。

2.2血小板的促肿瘤细胞转移作用 血小板是活跃的肿瘤细胞生长、外渗和转移过程的参与者。血小板是骨髓造血组织成熟的巨核细胞产生的细胞质碎片，激活后释放碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、表皮生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子-β、基质金属蛋白酶等。

血小板是最早与血管内肿瘤细胞相互作用的细胞[11]，其促肿瘤转移效应表现为：①血小板衍生的外泌体信使RNA和微RNA可以介导血小板与其他细胞类型之间基于基因的交流，从而调节靶细胞中蛋白质表达[12]。②血小板衍生生长因子、表皮生长因子等具有促有丝分裂原活性，可促进肿瘤新生血管形成；基质金属蛋白酶、5-羟色胺、组胺等可收缩血管内皮细胞、降解血管基质、增加新生血管的通透性；转化生长因子-β作为EMT重要诱导因素，通过肿瘤细胞中的核因子κB信号通路传导，诱导、维持CTCs的EMT状态，参与CTCs的形成[13]。

CTCs向远处迁移时受到血流的剪切损伤以及免疫杀伤，而血小板对CTCs具有保护作用：①血小板与纤维蛋白原结合，并在整合蛋白、选择素、黏附分子、腺苷三磷酸的作用下在CTCs表面包裹形成“血小板-纤维蛋白原-CTCs”复合物，发挥屏障保护作用[14]，并且CTCs通过分泌活化血小板的腺苷二磷酸、表达组织因子或释放血栓形成和促凝微粒来增强复合物形成[15]。②血小板表面的主要组织相容性复合体Ⅰ分子被动转移到CTCs表面，CTCs通过模拟宿主细胞逃避免疫清除[16]。③血小板通过细胞因子(如转化生长因子-β)介导的自然杀伤细胞活化型受体NKG2D(natural-killer group 2,member D)下调抑制自然杀伤细胞的抗肿瘤活性，减轻对CTCs的免疫损伤[11]。

2.3肿瘤微环境的促肿瘤细胞转移作用 肿瘤细胞与其周围环境(如间充质细胞及纤维组织)一起构成了具有肿瘤特异性、适于肿瘤生长的肿瘤微环境。肿瘤微环境在促进肿瘤发生和肿瘤细胞转移中的重要性已得到越来越多的认识。

快速分裂的突变细胞增殖速度超过了氧气的供给速度，形成了肿瘤微环境的特征之一——低氧。在低氧环境下，一方面缺氧诱导因子-1α亚基降解受到抑制而大量聚集在肿瘤细胞核内；在共激活因子作用下，与缺氧诱导因子-1β亚基形成稳定的二极体复合物，激活下游基因表达、改变细胞能量代谢方式，并诱导毛细血管生成、加速肿瘤细胞分裂增殖、CTCs形成[17]；另一方面，缺氧不仅可抑制自然杀伤细胞的抗肿瘤作用和T淋巴细胞的毒性作用[18]，还招募免疫抑制细胞降低适应性免疫的抗肿瘤活性，在CTCs血行转移过程中发挥免疫逃逸作用[19]。

肿瘤微环境的另一特征是低pH。糖酵解代谢增高是肿瘤微环境中酸性增加的直接原因[20]。微环境酸中毒对肿瘤细胞的局部浸润与组织重塑有重要的调控作用：①酸性微环境可以释放和激活蛋白水解酶(半胱氨酸、天冬氨酰等)，使细胞外基质降解促进肿瘤转移[21]；②与细胞外环境相比，肿瘤细胞内的相对碱性环境对肿瘤细胞增殖有促进作用[22]；③酸性微环境增加细胞毒性，导致正常细胞发生凋亡和坏死，而肿瘤细胞由于获得性适应得以存活甚至增殖[23]。随着正常细胞死亡和细胞基质降解，肿瘤细胞可继续扩散并侵入至正常细胞死亡以及基质降解后的空间，这种酸性微环境介导的肿瘤浸润策略可促进恶性肿瘤细胞的局部浸润和体内转移。

3 CTCs在结直肠癌诊疗中的应用

3.1CTCs用于结直肠癌早期诊断及临床分期 恶性肿瘤被认为是全球主要的死亡原因，其中结直肠癌发病率(6.1%)位居第四、死亡率(9.2%)位居第二[24]。因其发病初始症状隐匿，患者确诊时多发展为中晚期，治疗效果欠佳，因而结直肠癌早期筛查方法与良好的预后相关。CTCs作为一种新型前瞻性的肿瘤标志物，在患者出现相关症状或具有明显影像学表现前，其异常升高具有警示作用。一项通过逆转录定量聚合酶链反应技术对735例Ⅱ期和Ⅲ期结直肠癌患者进行的大规模研究显示，181例外周血检测到CTCs异常增高[25]。此外，结直肠癌患者CTC阳性率TNM分期、原发肿瘤浸润深度、淋巴结转移呈正相关，故可结合CTCs检测和TNM分期评估患者预后[26-27]。由此可见，CTCs检测有利于早期发现肿瘤细胞、评估临床分期，从而有助于提供早期抗肿瘤治疗。

3.2CTCs用于结直肠癌疗效评价与预后判断 接受化疗的结直肠癌患者，可以通过监测CTCs评价患者的治疗效果。Tan等[28]监测9例结直肠癌伴远处转移患者化疗期间CTCs的研究表明，CTCs水平可反映癌胚抗原无法显示的患者化疗反应和疾病进展情况。Cohen等[29]通过检测430例转移性结直肠癌患者在化疗前和化疗期间不同时间点的CTCs水平发现，化疗3～4周后CTCs阳性患者的疾病进展率更高、治疗前和治疗中CTCs的数量是转移性结直肠癌患者无进展生存期和总生存期的独立预测指标。一项纳入3 129例结直肠癌患者的Meta分析证明，CTCs的检出表明结直肠癌患者的无进展生存期和总生存期较差，与检测方法无关，CTCs的存在是患者生存预后不良的独立预测因素[30]。在治疗过程中，动态性检测外周血中CTCs可以初步评价患者的治疗效果及预后，有助于对肿瘤进行个体化治疗。

3.3CTCs用于结直肠癌治疗后复发的风险评估 远处转移目前仍是消化道肿瘤相关死亡的主要原因[2]。相当一部分接受根治性手术的早期患者术后5年内仍可发生复发、转移。与传统肿瘤标志物(如癌胚抗原、糖类抗原199)相比，CTCs对肿瘤复发更敏感[4]。一项对211例结直肠癌患者进行的前瞻性队列研究显示，术后CTCs阳性是肿瘤患者预后不良的独立指标，与术前CTCs阳性相比，术后CTCs阳性患者术后3年内的复发风险更高[31]。对mFOLFOX化疗后行根治性手术的Ⅲ期结直肠癌患者的研究发现，化疗后持续CTCs阳性可能是预测复发和预后的潜在标志[32]，故对于此类患者的治疗应引起重视。

4 CTCs临床应用面临的挑战

CTCs检测可用于结直肠癌等多种实体恶性肿瘤的非侵入性诊断，在肿瘤早期诊断、监测肿瘤转移、肿瘤患者预后评估、判断治疗效果、确定耐药机制等方面具有重要临床价值。它可以“实时、动态”监控肿瘤的进展和遗传异质性，这是实现精准医学的重要环节。但其临床应用实践尚面临以下挑战。第一，CTCs检测技术迥异导致检测结果存在差异[33]。需要标准化的CTCs检测流程(细胞富集、血液样品处理与储存等)，以减少各项研究之间的差异；第二，当前尚无法纯化出全部类型的具有完整活性、高灵敏度的CTCs[34]，且现有富集方法也无法检测间充质转换细胞，仍需要优化富集检测分离技术；第三，CTCs临界值不明确。在使用CTCs计数评价肿瘤患者预后时，不同肿瘤的CTCs临界值有所不同，即使同一肿瘤也没有统一明确的临界值，因而难以通过CTCs计数验证结论的准确性；第四，当前CTCs单独作为肿瘤的靶向标志物存在不足。在一些非肿瘤患者(如慢性肝炎或炎症性肠炎)外周血中亦可检测出低水平的CTCs，且尚缺乏CTCs优于影像学诊断的临床证据；第五，目前CTCs检测成本昂贵，尚无法大规模应用于临床。

5 小 结

近年随着CTCs检测技术的不断进步，作为肿瘤组织的替代物，CTCs成为结直肠癌、肺癌、乳腺癌等肿瘤相关研究的焦点。CTCs检测作为全新的液体活检技术，具有创伤小、可重复、动态监测等优点，在识别早期肿瘤患者、疗效评价及复发风险评估等方面发挥着重要作用，具有较高的临床价值。寻找一种公认、快速、低成本且敏感性和特异性高的提取CTCs完整信息的富集分离方法，对于CTCs在肿瘤诊断、疗效评估及预后判断等方面发挥更高的临床价值，并为临床诊疗提供全面且有价值的指导、助力肿瘤个体化治疗和精细化管理具有重要意义；开展更多基础实验研究，并通过大规模、多中心的前瞻性临床研究验证CTCs的临床应用价值，可为CTCs检测的最佳临床用途提供新的见解。