上皮间质转化引起非小细胞肺癌耐药的机制及中医药治疗进展*

夏尽力 邓海滨

上海中医药大学附属龙华医院肿瘤二科，上海 200032

上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮细胞获得间充质表型的基本形态发生过程，其在肿瘤的侵袭、转移和耐药中起到重要的作用。近年来，EMT在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)耐药中的作用受到广泛关注。许多EMT相关的信号通路、转录因子都被证实参与了NSCLC治疗耐药，靶向EMT也被认为是克服耐药的新机会。中医药在干预EMT引起的NSCLC耐药中扮演了重要的角色，能够通过抑制EMT的发生而延缓肿瘤耐药，从而起到增效减毒的作用。现本文就EMT引起NSCLC耐药机制及中医药干预治疗进展进行概述如下。

1 EMT及其相关信号调控

1.1 EMT概述

经历EMT后，上皮细胞标志物E-钙粘蛋白(E-cadherin)、闭合蛋白(Occludin)等表达下降，并开始表达间质标志物N-钙粘蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、纤维连接蛋白(Fibronectin)等，在大多数情况下，E-cadherin的丢失或表达降低是EMT的标志。EMT并不是简单的从上皮到间质表型的转换，在肿瘤进展过程中，EMT通常诱导上皮细胞处于混合的上皮-间充质状态，在各种内源性和外源性信号的影响下，细胞可以变得更具间质表现或恢复到更具上皮性的表型(间质-上皮转化)，它被认为与肿瘤干细胞表型和多重耐药的发展有关[1]。EMT过程中基因表达的变化导致了大量的表型变化，如细胞形态变化、粘附丧失和获得干细胞样特征，从而导致了肿瘤侵袭、转移及耐药。

1.2 EMT相关信号通路及转录因子

EMT涉及的信号通路十分复杂，目前有关具体机制尚未全部掌握。其中关键的信号通路包括转化生长因子β(TGF-β)、Wnt、Notch和Hedgehog等。在NSCLC中，TGF-β是研究重点。TGF-β通过Smad依赖途径和非Smad依赖途径介导EMT的发生。在Smad依赖途径中，TGF-β配体在细胞表面结合的I型受体(ALK5)被II型受体磷酸化，这导致Smad2、Smad3磷酸化，并与Smad4形成复合物；TGF-β受体激活后，Smad复合物不仅能激活转录因子的表达，而且能提高转录因子的活性，如诱导Vimentin、Fibronectin等间充质基因的表达，从而导致EMT的发生和肿瘤的侵袭转移及治疗耐药。在非Smad依赖途径中，TGF-β通过RHO-GTP酶、PI3K和MAPK等介导EMT的发生。其他信号通路，包括Notch，Wnt，Hedgehog，也参与在EMT中。这些信号通路导致了转录因子的激活，其中包括的SNAIL、E12/E47、TWIST1/TWIST2和ZEB1/ZEB2等已经被确定为EMT的主要调控因子。还有一些新的EMT转录因子，如SOX和FOX转录因子[2-3]；这些转录因子是EMT的重要诱导者，在EMT的发生发展中起重要作用。例如SNAIL(又称SNAIL1)和SLUG(又称SNAIL2)在胚胎发育、组织纤维化和肿瘤转移过程中可激活EMT过程，抑制上皮表型基因的表达；SNAIL既能参与抑制E-cadherin基因的表达，还可激活间质表型基因的表达，从而发挥促进EMT的作用。TWIST1、TWIST2属于bHLH转录因子，在EMT的发生、发展过程中亦具有关键作用。与SNAIL一样，TWIST也可下调上皮表型基因的表达，并激活间质表型基因的表达。在肿瘤细胞中，TWIST1可通过组蛋白甲基化抑制E-cadherin的启动子、激活N-cadherin的启动子，从而抑制E-cadherin的表达，并诱导N-cadherin的表达，促进EMT的发生；与TWIST1相比，TWIST2具有更强的诱导EMT的作用。其他转录因子，如ZEB1、ZEB2、FOX和SOX对EMT也具有诱导和调节作用[4-7]。

2 NSCLC耐药

目前，肿瘤的耐药可分为固有性耐药和获得性耐药。固有性耐药是指肿瘤细胞初始便对药物不敏感，其耐药因子在治疗前已经产生；而获得性耐药是肿瘤细胞初始对药物敏感，但经过数个疗程的治疗，疗效逐渐降低而产生不敏感的现象，其耐药因子是在药物治疗过程中形成的；其耐药机制广泛且多样，如药物外排、EMT、肿瘤干细胞生成、药物靶点突变等。很多耐药因子都参与了肿瘤耐药过程。如肺耐药相关蛋白(lung resistance-related protein，LRP)可以介导细胞核和细胞质之间的细胞毒性药物的转运，使细胞内的药物浓度降低，诱导产生多药耐药(multidrug resistance，MDR)，尤其是对顺铂、阿霉素、足叶乙苷等化疗药物。磷酸化糖蛋白(phosphorylated glycoprotein，P-gp)由MDR1基因编码，其耐药性的产生是由于P-gp通过其疏水位点和疏水性与紫杉醇、蒽环类等化疗药物结合，将进入细胞内的药物泵出细胞，从而表现为耐药，P-gp高表达是导致MDR现象的重要依据。除P-gp、LRP蛋白外，肺癌的耐药性还与MRP蛋白、GST和TOPOⅡ酶、凋亡基因Bcl-2、p53表达水平有关，与NF-kB、PI3K/Akt、PKC信号通路等也有关[8-10]。在NSCLC中，转移和耐药(包括化疗和靶向治疗)仍然是患者生存率低的重要原因[11]。在临床上，化疗和靶向治疗已是成熟的癌症治疗方法，长期以来它们被用作单一疗法或与手术或放疗相结合来治疗肿瘤。然而，无论是经典的细胞毒性药物还是分子靶向药物都面临耐药性的挑战[12]。

3 EMT引起NSCLC耐药的主要机制

EMT与肿瘤耐药之间的关系虽然被研究了很久，但其具体的机制仍不清楚。在上皮性癌症发生过程中，具有间充质特征的细胞群体被认为与肿瘤的发生、发展、耐药有关。与上皮细胞相比，间充质细胞往往对多种抗癌药物具有更强的耐药性[13]。其可能与EMT促进肿瘤干细胞生成、下调细胞毒性药物诱导的癌细胞凋亡等有关。

3.1 EMT促进肿瘤干细胞生成引起耐药

肿瘤干细胞(CSC)是假定为具有干细胞特性的肿瘤细胞亚群，是具有无限自我更新能力和分裂能力的类干细胞。研究发现，相同肿瘤中的CSC比缺乏“干性”的肿瘤细胞(即非CSC)在常规化疗和靶向治疗后对药物的抵抗力更强，而CSC和非CSC之间的表型差异似乎主要归因于前者EMT程序的激活所引起的表观遗传学变化[14]。EMT还可以将循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTC)与CSC联系起来，使这些具有干细胞特性的肿瘤细胞亚群能够在外周循环中存活，导致耐药的发生[15]。

接受EMT的肿瘤细胞可获得干细胞样属性，从而促进CSC的产生。EMT与CSC具有共同的关键信号通路和耐药表型。通过激活Hedgehog、Notch和Wnt等途径，CSC表现出自我更新的能力。TGF-β可诱导EMT的产生，进而还可促进CSC生成[16]。胡翘廷等[17]发现经TGF-β1诱导NSCLC细胞株(PC-9)发生EMT后，CSC含量显著增加；发生了EMT的吉非替尼获得性耐药细胞株(PC-9/AB)中CSC含量明显高于PC-9细胞，通过逆转EMT，PC-9/AB细胞中CSC含量降低，并且对吉非替尼的敏感性部分恢复。

3.2 EMT下调细胞毒性药物诱导的癌细胞凋亡

吉非替尼等EGFR-TKIs通常被用于NSCLC的治疗，EGFR-TKI可以与EGFR的ATP位点结合，从而降低其活性，诱导癌细胞凋亡。然而，研究表明，间充质表型比上皮表型对EGFR-TKI更具抵抗力，EMT不仅与最初的敏感性有关，而且与对EGFR-TKI的获得性耐药有关，E-cadherin的恢复可增强NSCLC细胞对EGFR-TKI的敏感性[18]。

与EMT相关的SLUG蛋白是SNAIL蛋白超家族成员之一，SLUG蛋白的表达在耐药细胞模型中起着关键作用。研究发现，与吉非替尼敏感株(PC9)相比，吉非替尼耐药株(PC9/gef)中SLUG蛋白表达显著增加，从而阻止靶向药物诱导肿瘤细胞凋亡。而SLUG蛋白表达下调不仅可以逆转EMT的发生，还可以恢复靶向药物的敏感性。癌细胞凋亡与内在的凋亡途径有关，该途径可分为抗凋亡蛋白、促凋亡蛋白和BH3-only蛋白。经吉非替尼处理后，BH3-only蛋白和抗凋亡蛋白均无明显变化，而促凋亡蛋白Bim的3种亚型表达量均显著提高，SLUG蛋白通过下调Bim来产生吉非替尼的耐药性[19]。Notch通路也被报道与耐药有关，Notch-1可以直接或间接的调控促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白来调节癌细胞的存活。研究发现，吉非替尼耐药株中Notch-1表达高度上调，Notch-1可以保护NSCLC细胞免受吉非替尼诱导的凋亡，沉默Notch-1的表达后逆转了EMT的发生。Notch抑制剂DAPT可使吉非替尼耐药株恢复对吉非替尼的再敏感，并在肿瘤生长抑制方面产生了有效的反应[20]。

4 中医药干预NSCLC耐药的研究进展

4.1 单味中药在NSCLC耐药的作用

中医药可广泛应用于NSCLC治疗的各个阶段，对NSCLC的治疗作用不可忽视。研究表明，许多单味中药和中药复方可提高NSCLC对细胞毒性药物和分子靶向药物的疗效。三七具有化瘀止血、活血定痛的作用，其有效成分为三七总皂苷。阮越勇等[21]发现在三七总皂苷干预下，经历过TGF-β1介导产生EMT的A549细胞E-cadherin增高，Fibronectin和Vimentin降低，提示三七总皂苷能使上皮细胞保持原来的特性，逆转EMT并延缓靶向耐药的发生。姜黄具有破血、行气、通经、止痛的作用，姜黄素是从姜科、天南星科植物的根茎中提取的化学成分。李优等[22]研究发现，姜黄素不仅能够逆转TGF-β1介导的NSCLC发生EMT，还可以逆转TGF-β1介导的A549细胞发生侵袭转移。姜黄素能够抑制E-cadherin的下调，显著降低N-cadherin和Vimentin的表达，且与姜黄素的浓度呈现一定的剂量依赖性。高宝安等[23]研究证明白花蛇舌草乙醇提取物使肺腺癌耐药细胞株(A549/DDP)对顺铂的耐药倍数下降近一半，对顺铂的敏感性增加近两倍，并显著降低多药耐药相关蛋白的表达。苦参具有清热燥湿、利尿的功效。沈云飞等[24]发现，苦参可以降低吉非替尼诱导的NSCLC耐药细胞(PC9/ZD)中Vimentin及N-cadherin的表达，增加E-cadherin表达，提示苦参可逆转PC9/ZD细胞发生EMT和增加其对EGFR-TKIs的敏感性。

4.2 中药复方在NSCLC耐药的作用

较单味中药而言，中药复方防治或延缓NSCLC耐药的发生效果更佳。罗杨等[25]研究发现，吉非替尼联合除痰解毒方比单用吉非替尼效果更佳，能延缓靶向耐药的发生，提示了除痰解毒方对NSCLC的治疗具有协同增效的作用；而其逆转NSCLC靶向耐药的机制与升高E-cadherin，降低SNAIL和Vimentin，从而逆转EMT有关。张敏等[26]实验研究发现，中药复方益气养阴解毒方能在不降低EGFR-TKI疗效的前提下，减少皮疹、腹泻等不良反应的发生，明显改善患者的生活质量，其有效性及安全性均优于单纯EGFR-TKI组，并减少耐药的产生，具有增效减毒的作用。汪一帆等[27]研究发现使用中药抑肺饮后，Lewis肺癌中E-cadherin的表达量上升，且抑肺饮联合顺铂组表达量最高；而Vimentin呈下调状态，并在抑肺饮联合顺铂组中最低。肺岩宁方主要由白术、生黄芪、干蟾皮、山慈菇、石见穿、黄精等益气养精、抑癌解毒中药组成，对NSCLC起攻补兼施之功效。赵晓珍等[28-29]研究发现经肺岩宁方治疗后，EMT发生过程中的Vimentin虽无明显改变，但Fibronectin和N-cadherin的表达显著性下降；与EMT相关的TWIST、SNAIL在肺岩宁方联合顺铂组表达显著降低，E-cadherin显著升高；提示了肺岩宁方可以逆转EMT的发生。康小红等[30]研究结果显示，肺岩宁方联合靶向药物治疗晚期肺腺癌的中位疾病进展时间明显优于单用靶向药物治疗组，提示肺岩宁方具有一定的延缓或防治EGFR-TKIs耐药的作用；同时发现EGFR-TKI耐药的细胞株上皮出现间质细胞表型，证实了EMT的发生，提示肺岩宁方延缓耐药的机制与EMT有关。

5 问题与展望

EMT在NSCLC治疗耐药起到了重要的作用。然而，引起NSCLC耐药的机制比较复杂，EMT并不是唯一的因素，且现代研究也没有阐明EMT引起NSCLC多重耐药的具体机制。因此有待进一步围绕EMT相关信号通路、基因水平等展开更加深入的研究。现代医学治疗NSCLC的方法已经相当成熟，但容易产生耐药性，毒副作用较多，对身体的损伤也较大。中医药减小肿瘤体积的能力虽不如现代医药，但现代医药联合中医药可以有效逆转EMT引起的NSCLC治疗耐药问题，达到事半功倍的效果；同时，还可以极大地减少现代药物带来的皮疹、腹泻等毒副作用。可见，中西医结合治疗NSCLC将为干预EMT途径引起的NSCLC治疗耐药提供新思路。