Notch信号通路与肝癌细胞凋亡关系的研究进展

崔普泽，胡彦建，贺旺，胡彦华

（1.哈尔滨医科大学附属第二医院 普通外科，黑龙江 哈尔滨 150086；2.哈尔滨工业大学附属哈尔滨市第一医院 消化内科，黑龙江 哈尔滨 150010）

肝癌是常见的恶性肿瘤之一，高居世界癌症发病率第5位和癌症病死率第4位[1]。尽管肝癌的5年生存率已从40 年前的3%提升到目前的18%，但仍远远低于全球发病率高的其他实体肿瘤，例如大肠癌、乳腺癌、前列腺癌的5年生存率分别为65%、90%、98%[2]。美国肝癌死亡人数2000 年到2016 年增加了43%，从每10万人死亡7.2人上升到10.3人。根据世界卫生组织估计，2030 年将有100 多万患者死于肝癌[3]。提升肝癌生存率仍然是当今紧迫的难题。多种诱导肿瘤细胞凋亡的药物和疗法被证明对肿瘤治疗有效，诱导肝癌细胞凋亡希望成为更有前途的肝癌治疗方案。肝癌的发生和发展表现肝癌细胞凋亡的失调与大量细胞信号通路异常传导密切相关，如PI3K/AKT/mToR[4]、Wnt/β-catenin[5]、ras/raf/MRPK[6]、NF-κB[7]、Hedgehog[8]、Notch[9]等。Notch信号通路在组织发育和生理过程中高度保守，调控细胞凋亡。包括肝癌在内的各种肝脏疾病中，Notch信号通路均异常传导[10]。Notch信号通路对肝癌细胞凋亡的作用因细胞和分子环境不同，表现出抑制或促进细胞凋亡的作用[11]。本文就Notch信号通路在肝癌细胞凋亡中的作用及其机制做一综述。

1 Notch信号通路在细胞凋亡中的作用

Notch信号通路进化上高度保守，调节组织发育和内环境稳定[12]。Notch信号通路主要包括依赖和非依赖细胞核内转录因子CSL（C-promoter binding factor-1、CBF-1，Suppressor of hairless，Lag的合称）的两种Notch信号通路活化方式。依赖CSL的经典Notch信号传导通路开始于细胞膜的相互接触，Notch信号通路发送细胞（表达果蝇体内的Delta和Serrate及线虫体内的lag-2，DSL配体）膜和邻近的接受细胞（表达Notch受体）膜接触，启动Notch信号通路，信号接受细胞的Notch受体经过金属蛋白酶和γ-分泌酶介导的两次连续切割，释放Notch受体细胞内区（Notch intracellular domain，NICD），NICD易位至细胞核内，与细胞核内转录因子CSL结合，从而激活Notch信号通路的靶基因HES和HEY家族，调节细胞凋亡相关基因表达，调控细胞凋亡。非依赖CSL的Notch信号通路NICD并不易位至细胞核内，而是在胞浆中与其他信号通路（如β-catenin、PI3K/AKT等）蛋白相互作用，调控目标蛋白的表达，影响细胞的凋亡。细胞凋亡主要包括外源性途径和内源性途径。外源性途径又称为死亡受体途径，通过跨膜受体介导，活化天冬氨酸蛋白水解酶caspase家族，诱导细胞凋亡。内源性途径又称线粒体途径，刺激直接产生细胞内信号，引起线粒体膜结构改变，释放促凋亡物质，诱导细胞凋亡[13]。依赖CSL的经典Notch信号通过Hes1-PTEN-AKT-mToR途径调控细胞凋亡[14]，而非依赖CSL的Notch信号通路则通过NICD-mToR2-AKT-mToR介导细胞凋亡[15]。介于细胞类型不同和相关信号通路之间串扰的影响，Notch信号通路在同一肿瘤不同的细胞亚型和不同的肿瘤细胞系中表现出抑制和促进凋亡的不同作用[10，16]。Yoon等[17]通过转染的方法，使唾腺癌细胞过度表达Notch信号通路，结果细胞凋亡率明显下降，上调Notch信号通路抑制唾腺癌细胞凋亡。Wang等[18]应用小分子干扰RNA和γ-分泌酶抑制剂处理胰腺癌细胞，下调Notch信号通路，结果细胞凋亡率明显增加，从而间接证实了活化的Notch信号通路抑制细胞凋亡。此外，NICD移位进入细胞核内，激活Notch信号通路靶基因CDK2、VEGF和MMPS表达，抑制细胞凋亡[19-20]。Notch信号通路除表现抗凋亡作用，还表现促凋亡作用，例如在小鼠表皮和成年小鼠角膜上皮的研究中，Notch信号通路通过抑制β-catenin信号通路，促进细胞凋亡[21]。Notch信号通路对于同一细胞系的不同亚型亦表现出双重的凋亡作用，Notch信号通路激活后保护1 型β细胞免于凋亡，当应用γ-secretase抑制剂（gamma secretase inhibitor，GSI）处理细胞，下调Notch信号通路后，1 型β细胞凋亡显著增加，但对于2 型β细胞，采用GSI处理却上调抗凋亡基因Bcl-2，抑制细胞凋亡[22]。Notch信号通路在细胞凋亡中表现的抑制和促进凋亡作用，主要依靠不同的组织类型和其与其他细胞信号通路间的“串话”。

2 Notch信号通路在肝癌细胞凋亡中的作用

肝癌的发生发展与Notch信号通路的异常传导密切相关，因受肝细胞和肝脏成分细胞（如胆管细胞、内皮细胞、星状细胞、成纤维细胞和巨噬细胞等）相互作用影响，不同肝癌组织中Notch信号通路呈上调或者下调的不同表达结果。Yang等[23]报道肝癌组织中Notch-1、Notch-3和Notch-4受体表达水平明显高于癌旁和正常肝脏组织，在肝癌和肿瘤周围组织之间未发现Notch-2 表达差异，Notch-3 的表达增加与肝癌的血管浸润性密切相关。Ahn等[24]研究取得了与Yang相同的Notch受体过表达结果，即肝癌组织中Notch-1、Notch-3和Notch-4高表达，同时报道了Notch-1高表达的患者预后具有高复发风险。Hu等[25]报道与正常肝组织相比，Notch-3在HCC组织中高表达，且Notch-3高表达的肿瘤体积更大、肿瘤更早复发、肿瘤分期更晚和总生存期更短的特点。此外，除肝癌组织外，研究显示HepG2 肝癌细胞系Notch-3受体、Jagged1和Deltal配体高表达[26]。然而，也有研究报道肝癌组织中Notch信号通路受体蛋白相对于正常肝组织低表达的结果。Sui等[27]收集肝癌组织样本30例，通过qRT-PCR分析，发现正常肝组织中Notch-1 mRNA的表达水平为（10.3±3.1），而肝癌组织中Notch-1 mRNA的表达水平为（5.1±2.1），肝癌细胞Notch-1 mRNA明显低于肝正常细胞，差异具有统计学意义（P＜0.05）。蛋白质免疫印迹分析，显示与正常肝组织相比，Notch-1蛋白的表达在肝癌组织中显著降低（P＜0.001），同时还发现与正常肝脏组织相比，肝癌细胞中NICD蛋白的表达显著降低（P＜0.001）。Notch信号通路在肝癌组织胞中的“对向”差异性，促使其在肝癌细胞凋亡中呈现双向作用。

2.1 下调Notch信号通路促进肝癌细胞凋亡

Notch信号通路上调的肝癌细胞，Notch信号通路抑制细胞凋亡。下调Notch信号通路，解除Notch信号通路抑制肝癌细胞凋亡的关键因子，打开凋亡途径，促进肿瘤细胞凋亡。

下调Notch信号通过PTEN/PI3K/AKT信号通路介导促进肝癌细胞凋亡。人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10，PTEN），是继p53 后又一个与多肿瘤发生发展密切相关的抑癌基因，其编码具有蛋白磷酸酶和脂质磷酸酶双重特异磷酸酶活性的蛋白，能使磷酸化的Tyr、Ser、Thr都去磷酸化；PTEN通过去磷酸化参与细胞调控。磷酸化和去磷酸化是调节细胞活动的重要方式，许多癌基因的产物都是通过磷酸化而刺激细胞生长[28]。PTEN主要抑癌机制是PI3K/AKT通路的主要负调控因子。PTEN可以使磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）催化产物第二信使磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸（PIP3）第三位的磷酸基团去磷酸化，从而对能促进细胞增殖生长的PI3K/Akt信号转导途径起到负调控作用。Tian等[29]在肝癌细胞系Huh-7 中过表达MicroRNA-760，下调Notch信号通路，增加PTEN蛋白表达，降低PI3K/AKT活性，结果凋亡执行蛋白caspase-3蛋白表达水平增加，肝癌细胞凋亡增加。Yang等[30]应用小分子干扰RNA处理HepG2细胞，抑制Notch1受体蛋白的表达，发现Akt磷酸化的水平随Notch1 受体蛋白表达的下降而降低，流式细胞结果显示HepG2细胞凋亡明显增加。下调Notch信号通路，解除HES对PTEN的抑制，上调PTEN蛋白的表达，从而抑制PI3K/AKT信号通路表达，诱导肝癌细胞凋亡。

Notch信号通路通过p53 介导调控肝癌细胞凋亡，p53是重要的肿瘤抑制基因，p53基因在正常情况下对细胞分裂起着减慢或监视的作用。p53 根据细胞DNA变异的程度而发挥不同作用，如果变异较小，p53 促使细胞自我修复，若DNA变异较大，p53诱导细胞凋亡。研究表明，Notch信号通路通过INK4a/ARF（inhibitor of CDK4/alternative of reading frame）的介导，干扰MDM2（murine double minute2）对p53的降解作用，下调Notch信号通路促进INK4a/ARF表达，减少MDM2对p53的降解作用，上调p53表达，诱导细胞凋亡[31]。Wang等[32]过表达RBP-Jinteracting and tubulin-associated（RITA），抑制Notch信号通路靶基因的转录，下调Notch信号通路靶基因HES1表达，结果发现RITA过表达增加p53的蛋白表达，诱导SMMC7721和HepG2细胞凋亡。Giovannini等[33]研究报道，沉默HepG2、SNU398和Hep3B细胞Notch3受体表达，导致p53上调，从而调控细胞周期蛋白G1表达以及miR-221和MDM2的前馈电路，促进肝癌细胞凋亡。

下调Notch信号通路通过内、外源途径调控肝癌细胞的凋亡。内源途径又称线粒体途径，主要是通过Bcl-2 和核蛋白改变线粒体膜结构。Bcl-2 家族主要包括：抗凋亡作用的Bcl-2，Bcl-xl，Mcl-L及Bcl-w等和促凋亡作用的Bax、Bak及Bok等[34]。Zhang等[35]研究报道，秋水仙碱（Silybin，SIL）下调肝癌细胞Notch信号通路NICD，RBP-Jκ和Hes1蛋白表达，下调凋亡通路相关蛋白Bcl-2 表达，并上调Bax表达，诱导细胞凋亡。Kunnimalaiyaan等[36]报道，在肝癌细胞株（HepG2、Hep3B和SK-Hep-1）中下调Notch信号通路表达，靶蛋白HES-1表达下降，细胞凋亡增加，其机制是下调Notch信号通路抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达，诱导凋亡小体形成。Ke等[37]通过药物TQ（thymoquinome）处理肝癌细胞，下调Notch信号通路，取得的结果与Kunnimalaiyaan等[36]报道的一致，下调Notch信号通路通过内源途径调控肝癌细胞的凋亡，抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少，凋亡蛋白Bax表达增加，肝癌细胞凋亡增加。外源性途径又称死亡受体途径，主要由膜上死亡受体介导，导致caspase-8活化，诱导肿瘤细胞凋亡。Huang等[38]研究发现，siRNA抑制Notch1的表达，有效的上调caspase-8表达，促进肝癌细胞H22的凋亡。

下调Notch信号通路配体Jagged1 表达，减少Notch信号通路激活，促进肝癌细胞凋亡。Ren等[39]报道，在肝癌细胞中过表达miR-199a-3p，有效地增加YAP1（yes associated protein 1）的表达，而YAP1直接抑制配体Jagged1表达，下调Notch信号通路激活，诱导肝癌凋亡。

下调动物体内细胞Notch信号通路，促进肝癌细胞凋亡。Zeyada等[40]应用氯硝柳胺聚合物胶束处理肝癌小鼠，蛋白免疫印迹结果显示Notch1受体和靶基因HES1表达显著下降，凋亡执行蛋白caspase-3的基因和蛋白表达水平增加，体内抑制Notch信号通路，促进肝癌细胞凋亡。Xiang等[41]在异种移植荷瘤肝癌裸鼠中，应用药物下调Notch信号通路表达，有效抑制肿瘤生长并促进肿瘤细胞凋亡。

Notch信号通路通过PTEN/PI3K/AKT信号通路、p53介导，或是调控Bcl-2和Bax凋亡蛋白表达等机制，诱导肝癌细胞凋亡，但是具体完整机制尚需要进一步的研究。

2.2 上调Notch信号通路诱导肝癌细胞凋亡

Notch信号通路促进肿瘤细胞凋亡的作用取决于肿瘤细胞的背景，除下调Notch信号通路促进肝癌细胞凋亡外，上调Notch信号通路亦可以促进肝癌细胞凋亡。Sui等[27]研究报道，Notch1质粒转染HepG2和Hep3B细胞，上调Notch信号通路，带有Notch1质粒的阳性细胞凋亡率明显高于对照（P＜0.001），上调Notch信号通路促进肝癌细胞凋亡，其作用机制是转染Notch1 质粒显著激活了2 种细胞系中JNK的磷酸化。JNK可以使位于c-Jun蛋白N端的氨基酸残基63和73磷酸化，上调caspase-3和Bax表达，下调Bcl-2表达，促进肝癌细胞凋亡。此外，Wang等[42]报道了上调Notch信号通路，激活外源性细胞凋亡途径，促进肝癌细胞凋亡的研究。研究人员将NICD转染到肝癌SMMC7721 细胞中，结果转染细胞24 h、48 h和72 h的细胞凋亡率呈现NICD剂量依赖性升高，其机制是上调的Notch信号通路，增加肝癌细胞p53表达，p53 的上调增加外源性细胞凋亡途径TRAIL/DR5的表达，促进TRAIL诱导肝癌细胞凋亡。已有研究表明，TRAIL触发的细胞凋亡是通过与死亡受体（DR4和DR5）结合并激活死亡受体来实现的，死亡受体属于肿瘤坏死因子受体基因超家族；死亡受体位于细胞表面，通过与配体TRAIL结合而变得三聚化，然后通过胱天蛋白酶级联反应快速激活来传递凋亡信号[43]。Qi等[44]激活Notch信号通路在体内体外均能诱导肝癌细胞凋亡，其机制是上调Notch信号通路增加p53的表达，高表达的p53可以通过上调Bax和下调Bcl-2表达水平促进肝癌细胞凋亡。

上调Notch信号通路促进肝癌细胞凋亡，下调Notch信号通路亦可以诱导肝癌细胞凋亡。Notch信号通路对肝癌细胞的双向作用，体现出Notch信号通路的传导简单性和作用复杂性的特点。进一步对Notch信号通路与其他细胞信号的“串话”研究，可能是解开Notch信号通路双向调控肝癌细胞凋亡的关键所在。

3 小结与展望

肝癌细胞凋亡是一个复杂的生理过程，需要大量的信号通路共同作用。Notch信号通路与其他信号通路“串话”，表现出既抑制又促进肝癌细胞凋亡的双向调控作用，这与肝癌细胞异质性密切相关，但详细的分子机制尚需进一步研究。寻找Notch信号通路双向调控肝癌细胞凋亡的关键点，打开Notch信号通路的细胞信号网络，将为肝癌的靶向治疗提供更广阔的应用前景。