苗药赤胫散乙酸乙酯部位的化学成分分离及鉴定*

王彬宇， 黄家宇， 杜秋莹， 陈思忆， 陈菊， 鲁婷婷， 李莉*

(贵州医科大学 药学院， 贵州 贵阳 550025)

苗药赤胫散(PolygonumruncinatumBuch.- Ham. Var. sinense Hemsl.)为蓼科蓼属植物赤胫散的干燥根茎，别名花蝴蝶、血当归等，其性寒、味苦、涩、性平及无毒，收载于《贵州省中药材、民族药材质量标准》2003年版，是西南苗族地区常用药[1-2]。苗药赤胫散主要分布于贵州、云南及湖北等地，民间常用于治疗腹痛、痢疾、急性胃肠炎、吐血咯血、痔疮出血、赤白带下、月经不调及跌打损伤等，外用治疗乳腺炎和痈疖肿毒[3]。目前文献对赤胫散的化学成分报道较少，主要集中在挥发油和鞣花酸类成分的研究[4-7]。现代药学研究证明，赤胫散提取物具有良好的抑菌作用[8]，本课题组前期对其体外抑菌活性部位进行筛选，发现乙酸乙酯萃取部最优[9]。为进一步明确其药效物质基础，本实验对赤胫散药材乙酸乙酯部的化学成分进行系统研究，分离并鉴定其中的化合物，现将结果汇报如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1药材来源 赤胫散药材产自贵州省贵阳市开阳县城关镇，经贵州医科大学药学院生药学教研室龙庆德副教授鉴定为蓼科蓼属植物赤胫散的干燥根。

1.1.2主要仪器与试剂 超导核磁共振波谱仪(德国BRUKER)，TSQ Quantum三重四极杆液质联用仪(美国Thermo Finnigan)，Sephadex LH-20(美国GE Healthcare)；厚制备板(烟台江友硅胶开发有限公司)，GF254硅胶薄层板、硅胶(80-100目、200-300目)购自青岛海洋化工有限公司；氘代甲醇和氘代吡啶(中国萨恩化学)，氘代氯仿(上海泰坦)；有机试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1赤胫散乙酸乙酯部位的提取 取赤胫散干燥根15 kg，粉碎成粗粉后用10倍量95%乙醇浸泡过夜，加热回流提取3次、3 h/次，合并提取液，浓缩后得到总浸膏；加水分散，用石油醚、乙酸乙酯及正丁醇依次萃取，浓缩得石油醚部位6.4 g、乙酸乙酯部位1.6 kg及正丁醇部位2.1 kg。

1.2.2乙酸乙酯部位初步分离 取乙酸乙酯部位样品380.7 g，加入适量二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行溶解，取80～100目硅胶适量，于恒温水浴锅上拌样(50 ℃)，至溶剂挥干，无明显颗粒感；取200～300目硅胶，采用湿法装柱，干法上样，然后用二氯甲烷-甲醇=(1 ∶0～0 ∶1)进行梯度洗脱，采用锥形瓶收集流份，通过薄层色谱法点样、展开、紫外灯下观察，合并相似的组分并进行编号，得到Fr.1～Fr.7。

1.2.3样品Fr.1-Fr.5分离与纯化 Fr.1重结晶得化合物1(493.0 mg)，经石油醚-乙酸乙酯(80 ∶1)硅胶柱层析得化合物3(594.7 mg)；Fr.2经二氯甲烷-甲醇(80 ∶1)硅胶柱层析、Sephadex LH-20(氯仿 ∶甲醇=1 ∶1)凝胶柱层析得化合物2(126.2 mg)；Fr.3经二氯甲烷-甲醇(50 ∶1)硅胶柱层析、Sephadex LH-20(氯仿 ∶甲醇=1 ∶1)凝胶柱层析得化合物9(42.3 mg)；Fr.4经二氯甲烷-甲醇(30 ∶1～0 ∶1)硅胶柱梯度洗脱得6个组分(Fr.4-1～Fr.4-6)，Fr.4-1经Sephadex LH-20(氯仿 ∶甲醇=1 ∶1)凝胶柱层析、制备薄层(乙酸乙酯 ∶丙酮=5 ∶1)层析得化合物4(10.8 mg)、化合物5(17.9mg)；Fr.4-2经Sephadex LH-20(氯仿 ∶甲醇=1 ∶1)凝胶柱层析得化合物6(23.0 mg)；Fr.5经二氯甲烷-甲醇(15 ∶1～0 ∶1)硅胶柱层析、Sephadex LH-20(氯仿 ∶甲醇=1 ∶1)凝胶柱层析得化合物7(11.7 mg)、化合物8(185.6 mg)。

2 结果

2.1 化合物1

白色片状结晶，C29H50O；ESI-MSm/z为437.36 [M+Na]+；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ为3.49～3.57(1H，m，H-3)、5.32～5.36(1H，m，H-6)、0.68(3H，s，H-18)、1.01(3H，s，H-19)、0.92(3H，d，J=6.4 Hz，H-21)及0.81～0.86(9H，ovelap，H-26,27,29)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ为37.26(C-1)、29.71(C-2)、71.83(C-3)、42.33(C-4)、140.77(C-5)、121.74(C-6)、31.92(C-7)、31.67(C-8)、50.14(C-9)、36.52(C-10)、21.10(C-11)、39.78(C-12)、42.31(C-13)、56.78(C-14)、24.32(C-15)、28.26(C-16)、56.06(C-17)、11.87(C-18)、19.41(C-19)、36.16(C-20)、18.79(C-21)、33.95(C-22)、26.07(C-23)、45.84(C-24)、29.16(C-25)、19.83(C-26)、19.04(C-27)、23.07(C-28)及11.99(C-29)。鉴定为β-谷甾醇。

2.2 化合物2

淡黄色粉末，C17H12O8；ESI-MSm/z为343.07 [M-H]-；1H NMR (600 MHz, Pyr)δ为7.84(1H，s，H-5)、8.06(1H，s，H-5′)、4.17(3H，s，3-OCH3)、4.22(3H，s，3′-OCH3)、3.88(3H，s，4′-OCH3)；13C NMR (150 MHz, Pyr)δ为111.61(C-1)、141.78(C-2)、141.14(C-3)、154.08(C- 4)、112.60(C-5)、112.90(C-6)、158.93(C-7)、113.60(C-1′)、142.11(C-2′)、141.51(C-3′)、154.31(C-4′)、107.85(C-5′)、114.08(C-6′)、159.03(C-7′)、61.10(3-OCH3)、61.34(3′-OCH3)及56.37(4′-OCH3)。鉴定为3,3′,4 ′-三甲基鞣花酸。

2.3 化合物3

淡黄色油状物，C16H22O4；ESI-MSm/z为279.12 [M+H]+和301.11[M+ Na]+；1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ为7.68～7.71(2H，m，H-2,5)、7.46～7.49(2H，m，H-3,4)、4.29(2H，t，J=6.8 Hz，H-1′)、1.66～1.73(2H，m，H-2′)、1.37～1.45(2H，m，H-3′)、0.92(3H，t，J=7.6 Hz，H-4′)、4.08(2H，d，J=6.4 Hz，H-1″)、1.99～2.05(1H，m，H-2″)，0.97(6H，d，J=6.8 Hz，H-3″,H-4″)；13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ为132.29(C-1,C-6)、130.74(C-2,C-5)、128.66(C-3,C-4)、167.32 (C-7,C-8)、65.20(C-1′)、30.46(C-2′)、18.97(C-3′)、13.54(C-4′)、71.46(C-1″)、27.60 (C-2″)及19.05(C-3″,C-4″)。鉴定为邻苯二甲酸正丁酯异丁酯。

2.4 化合物4

白色粉末，C8H8O4；ESI-MSm/z为167.02[M-H]-；1H NMR (600 MHz, MeOD)δ为7.55(1H，d，J=1.8 Hz，H-2)、6.71(1H，d，J=7.8 Hz，H-5)、7.46(1H，dd，J=7.8,1.8 Hz，H-6)及3.86(3H，s，3-OCH3)；13C NMR (150 MHz, MeOD)δ为128.07(C-1)、112.56(C-2)、147.16(C-3)、150.38(C-4)、114.25(C-5)、122.97(C-6)、174.49(C-7)及54.82(3-OCH3)。鉴定为香草酸。

2.5 化合物5

白色针状结晶，C9H10O5；ESI-MSm/z为197.05[M-H]-；1H NMR (600 MHz, MeOD)δ为7.33(2H，s，H-2,6)和3.88(6H，s，2×OCH3)；13C NMR (150 MHz, MeOD)δ为120.64(C-1)、106.91(C-2,6)、147.42(C-3,5)、140.29(C-4)、168.66(C-7)及55.37(2×OCH3)。鉴定为丁香酸。

2.6 化合物6

白色针状结晶，C7H6O3；ESI-MSm/z为137.07[M-H]-；1H NMR (400 MHz, MeOD)δ为7.90(2H，d，J=8.8 Hz，H-2,6)和6.84(2H，d，J=8.8 Hz，H-3,5)；13C NMR (100 MHz, MeOD)δ为121.41(C-1)、114.64(C-2,6)、131.61(C-3,5)、161.93 (C-4)及168.82(C-7)。鉴定为对羟基苯甲酸。

2.7 化合物7

淡黄色粉末，C7H6O4；ESI-MSm/z为153.01[M-H]-；1H NMR (400 MHz, MeOD)δ为7.43～7.46(2H，m，H-2,6)和6.82(1H，d，J=8.4 Hz，H-5)；13C NMR (100 MHz, MeOD)δ为121.78(C-1)、116.32(C-2)、144.66(C-3)、150.11(C-4)、114.35(C-5)、122.48(C-6)及168.90(C-7)。鉴定为原儿茶酸。

2.8 化合物8

无色针状结晶，C7H6O5；ESI-MSm/z为169.11[M-H]-；1H NMR (400 MHz, MeOD)δ为7.08(2H，s，H-2,6)；13C NMR (100 MHz, MeOD)δ为120.55(C-1)、108.92(C-2,6)、144.99(C-3,5)、138.20(C-4)及169.00(C-7)。鉴定为没食子酸。

2.9 化合物9

白色粉末，C9H10O5；ESI-MSm/z为197.03[M-H]-；1H NMR (600 MHz, MeOD)δ为7.05(2H，s，H-2,6)，4.27(2H，q，J=7.2 Hz，H-8)，1.34(3H，t，J=7.2 Hz，H-9)；13C NMR (150 MHz, MeOD)δ为120.37(C-1)，108.61(C-2,6)，145.08(C-3,5)，138.30(C-4)，167.18(C-7)，60.29(C-8)，13.25(C-9)。鉴定为没食子酸乙酯。

3 讨论

本研究从苗药赤胫散乙酸乙酯部位中分离鉴定了9个化合物，将分离化合物的波谱数据与国内外文献[5,10-21]进行比对，再通过质谱与化合物理化性质进一步分析，最终确定化合物1～9的结构归属。其中化合物3(邻苯二甲酸正丁酯异丁酯)、化合物4(香草酸)、化合物5(丁香酸)、化合物6(对羟基苯甲酸)及化合物7(原儿茶酸)等5个化合物为首次在该植物中分离得到，进一步完善了苗药赤胫散的化学成分信息，为其药效物质基础研究奠定了一定的理论基础，为赤胫散资源开发提供了实验依据。

本实验前期使用混合有机溶剂溶解样品，采用石油醚-乙酸乙酯、二氯甲烷-甲醇、乙酸乙酯-甲醇、石油醚-丙酮、三氯甲烷-甲醇分别作为展开剂进行薄层色谱分析，结果表明二氯甲烷-甲醇和三氯甲烷-甲醇的分离效果较好，具有良好的成点性，因三氯甲烷对光敏感，在光照下易被氧化生成剧毒光气且属于易制毒管制化学品，故选择二氯甲烷-甲醇作为赤胫散乙酸乙酯部位初步分离的洗脱剂。初步分段后根据各组分样品的极性大小和分离效果再进行洗脱剂的选择。

由于乙酸乙酯萃取部位的化合物为中大极性，故采用正相硅胶和葡聚糖凝胶 LH-20交替使用，通过反复柱层析使分离效果得到提高。经初步分离后Fr.1组分中观察到大量固体，重结晶后即得到化合物1，剩余母液中存在较多杂质，通过薄层色谱分析后采用石油醚-乙酸乙酯系统进行梯度硅胶柱层析，再通过反复凝胶纯化得到化合物3。因化合物4和化合物5极性相似、分子量大小相近，硅胶柱层析及凝胶均无法使其完全分离且样品量较少，尝试多种混合有机溶剂后最终选用乙酸乙酯-丙酮作为展开剂，通过厚制备薄层层析板进行分离与纯化。其余化合物大都经不同比例的二氯甲烷-甲醇系统通过正相硅胶柱多次梯度洗脱，再由葡聚糖凝胶 LH-20纯化得到。

在单体确定的过程中，使用多种不同极性的混合展开剂分别展开，在紫外灯下进行观察。同时，借助碘、10%硫酸乙醇等广谱显色剂及高效液相色谱等手段进行综合判断分析。最后，通过波谱与质谱等技术进行结构鉴定。

本实验首次在该植物中分离得到的香草酸(4)、丁香酸(5)、对羟基苯甲酸(6)及原儿茶酸(7)已被证实具有抗菌、抗病毒及抗氧化等药理作用[22-24]，为苗药赤胫散的抑菌活性物质，但当前对于酚酸类化合物的抗菌机制尚未完全明确[25]，有待深入研究。