恶性肿瘤相关静脉血栓栓塞症的研究进展

樊剑 赵家义 周慈航 刘百求 高雪峰 韩一平

1海军军医大学附属长海医院全科医学科,上海 200433;2海军军医大学附属长海医院呼吸与危重症医学科,上海200433

恶性肿瘤是临床上常见的慢性病,恶性肿瘤合并静脉血栓 (venous thromboembolism,VTE)患者的发病率高达20%,是癌症患者的重要并发症及非癌症死亡的主要原因[1]。目前对VTE研究较为广泛,癌症并发VTE 风险是普通人群的4～7 倍,通常发生在癌症确诊后的最初3 个月,加强适当的预防措施可以减少一半以上肺栓塞的病死率[2]。VTE危险因素包括癌症类型、分期、治疗和伴随疾病,其中胰腺癌、脑癌和卵巢癌的发生率最高[3]。VTE 相关的风险评估模型适用于预测原发性或复发性VTE,常见的 模型包括Khorana、Vienna CATS、PROTECHT、COMPASS-CAT、CATS列线图和Ottawa评分,但其敏感性、特异性有待进一步完善。生物标志物是近年来一直备受关注的研究热点,因其为无创、低成本、精准和易区分的可测量生物学参数,可有助于VTE的预测、诊断和预后模型的判断。本文对于VTE的流行病学、危险因素、生物学标志物等方面进行探讨。

1 流行病学研究

长期以来,癌症和VTE之间有着紧密的联系,癌症患者发生VTE的风险要比普通人群高得多。所有新发VTE中约20%与癌症有关,约8%的癌症患者在确诊或疾病进展后1年内发生了VTE[4]。Horsted等[5]报道癌症中VTE的发生率为每年1.4%,在转移性的高风险癌症患者中的总发病率为每年6.8%。目前癌症类型中并发VTE 发生率最高的是胰腺癌,其次是脑癌、卵巢癌,后续研究还发现恶性肿瘤相关VTE 的复发率为每年9.6%,恶性肿瘤相关VTE的病死率高达67.7%[6]。

2 危险因素

2.1 患者自身危险因素 癌症患者本身存在发展为VTE的危险因素,主要包括6种。(1)年龄:一般而言,VTE发病率随年龄呈指数增长,与45～54 岁年龄段相比,85岁以上的VTE发病率高出将近10 倍[7],然而Chew 等[8]在非小细胞肺癌患者的研究中,发现年龄小于45 岁患者VTE发生的风险是75岁以上患者的3倍。(2)性别:女性发生VTE的风险更高,男性则更容易发生动脉血栓[9]。但也有研究得出相反结果,发现性别与VTE 的发生率无关[8]。(3)种族:Khorana等[9]研究表明,黑人的VTE 发生率最高,其次是白人和西班牙人。相反,也有报道称种族之间VTE的发生率无显著差异[10]。(4)伴随疾病:研究证实存在伴随疾病与VTE形成的风险增加有关,如肾衰竭、呼吸系统疾病、心脏病、肥胖症和急性感染等,其中急性感染与VTE发生风险最为密切[8]。(5)制动:研究发现活动能力较差的患者有较高的VTE 发生率,且卧床≥3 d与VTE发生率显著升高有关[11]。(6)VTE 病史:既往VTE病史是发生VTE的主要危险因素,具有既往VTE 病史复发风险增加6～7倍[12]。

2.2 癌症相关的危险因素 癌症特定的发生机制与VTE形成有关,主要包括4种。(1)癌症部位:不同的癌症发生部位并发VTE的可能性不同,如胰腺、子宫、肺、胃和脑与VTE的风险增加相关。研究发现,胰腺癌VTE 发生率最高,女性中卵巢癌、乳腺癌和肺癌的VTE 发病率较高,男性中前列腺癌、大肠癌和肺癌的VTE 发病率较高[13]。(2)癌症分期:晚期癌症患者出现VTE 的风险更高。癌症并发VTE的风险与分期呈正相关,无转移的癌症患者并发VTE风险增加约4倍,而有远处转移的患者风险增加约58 倍[14]。(3)病理类型:癌症的组织学亚型与VTE风险发生率有关。肺癌和卵巢癌的组织亚型表现出不同程度的VTE 风险,如腺癌并发VTE 的风险较鳞癌高,而结肠癌和乳腺癌的其他组织亚型不能预测VTE 的发生率[15]。(4)诊断后时间:癌症诊断后的近期是发生VTE的风险最高的时期。癌症诊断后的初期与较高的VTE风险相关,在诊断后的前3个月中风险最大[15]。

2.3 癌症治疗相关的危险因素 恶性肿瘤相关VTE 形成与癌症治疗方式有关,主要包括4种。(1)手术:VTE 是术后常见的并发症,癌症患者术后VTE 的风险增加2倍,肺栓塞的风险增加3倍以上[16]。(2)化疗:化疗是癌症并发VTE的独立危险因素,化疗导致VTE 形成的风险增加。在化疗开始后的12个月中癌症患者的VTE 发生率增加了6～7倍[17-18],以顺铂为基础化疗后的患者存在静脉和动脉血栓的重大风险,其他免疫抑制剂或细胞毒性化疗也增加VTE的风险,如L-天冬酰胺酶等。(3)血管生成抑制剂:贝伐珠单抗是靶向循环血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF)的单克隆抗体,癌细胞释放VEGF并激活内皮,并有研究表明贝伐珠单抗可增加动脉血栓的发生风险[19]。(4)中央静脉导管 (central venous catheters,CVC):CVC 置入对癌症治疗有至关重要的作用,CVC相关VTE发生率在5%～30%之间,发生VTE可导致治疗中断,并引起肺栓塞和静脉血栓后综合征[20]。

3 生物标志物及临床意义

3.1 细胞外囊泡 (extracellular vesicles,EVs) 国际细胞外囊泡学会将EVs定义为 “从细胞中自然释放的,由脂质双层界定且无法复制的颗粒的通称”[21]。微囊或微粒通常是指尺寸≤1 000 nm 且源于细胞质膜的EVs。癌细胞能够脱落EVs,EVs 可能包含细胞特异性表面物质,如RNA、DNA、蛋白质和脂质。EVs的固有促凝血活性源于其带负电荷的质膜,质膜是维生素K 依赖性凝血因子Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ和凝血酶原的催化层面,负电荷是由于钙依赖性稀疏酶 (如TMEM16F)在形成EVs时从内质膜小叶的氨基磷脂不对称化产生的[22]。EVs上的磷脂酰丝氨酸通过其带正电的γ结合凝血因子-羧基谷氨酸结构域,从而提高磷脂依赖性凝血反应 (如酶和凝血酶原复合物)的催化效率。

目前关于EVs总数量与VTE 风险的研究有限,通过测定凝血酶原酶,发现带负电荷的磷脂暴露导致EVs的促凝血活性与VTE风险没有显著相关性,其临床意义有待进一步研究[23]。

3.2 组织因子 (tissue factor,TF) TF是一种促凝血蛋白,可启动凝血的外部途径,形成凝血酶和纤维蛋白凝块。TF在血管外细胞 (如成纤维细胞和血管平滑肌细胞)上表达,并结合凝血因子Ⅶ以稳定其催化域,以促进凝血因子Ⅸ和Ⅹ的下游激活;此外,也可以在单核细胞和内皮细胞中被配体 (如脂多糖)激活后诱导TF表达并在TF阳性细胞外小泡 (TF+EVs)中释放[24]。癌症可以组成性表达TF并在TF+EVs释放,包括乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胃癌、脑癌和胰腺癌。然而,癌症患者中TF+EVs的来源尚不清楚,可能在内皮细胞、单核细胞和巨噬细胞中产生TF+EVs[25]。目前仅在胰腺癌小鼠模型中显示出TF或TF+EVs与VTE风险的相关性,表明血小板依赖性和非依赖性途径用于TF+EVs诱导的VTE 形成[26]。在血小板依赖性VTE 形成中,TF+EVs通过结合如P-选择素之类的标志物定位在血栓部位,以通过TF 依赖性途径激活和聚集血小板。

TF+EVs的临床意义主要表现在胰腺癌患者中,通过TF依赖因子Ⅹa的产生,TF+EV 活性≥2.5 ng/L 时发生VTE风险为4.78倍,同时,TF+EV 数量或功能升高时,发生VTE的风险增加76%[27]。

3.3 中性粒细胞 活化的中性粒细胞可形成中性粒细胞胞外杀菌网络 (neutrophil extracellular traps,NETs),NETs含有组蛋白、DNA 和中性粒细胞衍生蛋白的细胞外纤维。在VTE形成过程中,中性粒细胞是第一个到达血管损伤部位的白细胞,多种因子刺激中性粒细胞可以诱导NETs形成由血小板、红细胞和其他促凝分子组成的血栓支架,包括活化的内皮细胞、血小板、IL-8、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和粒细胞集落刺激因子 (granulocyte-colony stimulating factor,G-CSF)等[28]。NETs形成期间,中性粒细胞肿胀并失去其核膜完整性,形成染色质、组蛋白和颗粒衍生蛋白的混合物。NETs中存在的组蛋白通过Toll样受体-2、受体-4 激活血小板,从而导致凝血酶生成。组蛋白诱导内皮细胞释放并结合糖蛋白Ⅰb (glycoprotein Ⅰb,GPⅠb)和血管性血友病因子 (von Willebrand factor,v WF),从而导致血管壁黏连,其中血小板的组蛋白非依赖性激活可以通过血小板与无细胞DNA (cell free DNA,cf DNA)的直接结合或通过与组织蛋白酶G 的催化反应[29]。NETs上存在组织蛋白酶G 和中性粒细胞弹性蛋白酶,并抑制TF 途径抑制剂以增强TF和Ⅻ因子依赖性纤维蛋白以促进VTE 的形成;中性粒细胞和肿瘤细胞产生的EVs通过磷脂酰丝氨酸-组蛋白相互作用形成NETs,促进VTE 形成。在癌症小鼠研究中,中性粒细胞、G-CSF、cf DNA、瓜氨酸化组蛋白H3(citrullinated histone H3,H3Cit)与NETs 的形成增加有关[30]。

NETs在部分癌症类型相关VTE 中有一定临床意义。研究表明在胰腺癌和肺癌显示出H3Cit水平升高时VTE的风险显著增加,血浆H3Cit每升高100μg/L 会使VTE风险升高11%[31]。

3.4 炎症分子 癌细胞合成并分泌具有多种促凝血功能的多种炎症分子,包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和VEGF,其中TNF-α、IL-1β和IL-6可以诱导内皮细胞TF的表达和活性。TNF-α促进癌细胞的EVs释放,在肺癌和胰腺癌等肿瘤细胞的EVs上发现TF 活性升高;TNF-α和IL-1β还可上调纤溶酶原激活物抑制剂1 (plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1),其中IL-1β可由活化的血小板在多核糖体中的信使前RNA 合成,活化后可与信使RNA(messenger RNA,mRNA)剪接,并可以在血小板EVs中释放与其他炎症细胞相互作用[32]。血小板还可表达IL-1受体,与IL-1β处于自分泌循环中,以增强血小板活化。IL-8表达可由纤维蛋白诱导,并显示出诱导粒细胞趋化性和NETs形成,此外,VEGF 可以通过转录上调内皮细胞的TF表达[33]。

有关炎性分子预测VTE风险的临床意义尚不明确。研究表明,卵巢癌患者血浆IL-6水平≥20 ng/L 时发生VTE风险是8.9倍;在胶质瘤患者中,趋化因子配体3(chemokine ligmant-3,CCL3)每升高2倍ng/L,VTE 风险降低约60%～80%;在转移性结直肠癌患者的研究中,化疗前,血清TNF-α低水平 (＜6.6 ng/L)时可将VTE风险降低83%;癌症患者中可溶性VEGF每增加10 ng/L,VTE风险增加4%[34]。相反,弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的研究显示,VTE风险与IL-6、IL-10或TNF-α无关;实体瘤患者的IL 分子或CCL3 与VTE 风险无显著相关性[35]。

3.5 膜黏蛋白 (podoplanin) 膜黏蛋白是一种跨膜糖蛋白,通常存在于多种正常组织中,包括淋巴管内皮细胞、肾脏细胞、Ⅰ型肺泡细胞和淋巴结成纤维网状细胞,但是蛋白虽然不存在血管内皮细胞时也可表达于癌症组织中如鳞癌、生殖瘤、脑瘤、间皮瘤和急性早幼粒细胞白血病等[36]。膜黏蛋白与血小板上的C 型凝集素样受体2 (Ctype lectin-like receptor 2,CLEC-2)结合,诱导血小板活化和聚集。在脑癌及胰腺癌患者血液EVs中观察到膜黏蛋白的表达升高[37]。小鼠黑素瘤模型显示通过CLEC-2-膜黏蛋白相互作用导致膜黏蛋白依赖性血栓形成,膜黏蛋白可能来自癌细胞,但也可以由宿主血管细胞中的血栓炎症因子异常诱导形成;在下腔静脉狭窄的小鼠模型中,48 h后在下腔静脉血管壁细胞表达足蛋白[38]。

膜黏蛋白主要在脑癌和神经胶质瘤中有临床意义,当脑癌患者膜黏蛋白表达＞70%时VTE风险增加;神经胶质瘤患者膜黏蛋白表达≥30%与VTE风险相关,但估计风险的准确性较低[39]。

3.6 细胞外微小RNA (microRNAs,miRNA) miRNA是小的非编码RNA,长度约为20～22个核苷酸,可作为基因表达的抑制剂。miRNA 在3'-非翻译区与靶mRNA 上的互补序列结合,并与Argonaute蛋白质形成miRNA 诱导的沉默复合物,导致mRNA 降解[40]。miRNA 可以释放到与Argonaute蛋白质结合的血浆或囊泡中。在血小板中也发现miRNA,其可在EVs中脱落,并转移到其他细胞进行基因调节,表明细胞间信号传导的潜在作用。miRNA 的失调与促凝表型增加有关。在急性、非癌性深静脉血栓的对照研究中,VTE形成和复发性VTE 患者也显示出截然不同的miRNA 特征[41]。

miRNA 用于预测癌症并发VTE风险的研究非常有限。对胰腺癌和胆管癌患者的研究,评估miRNA 对原发性VTE的预测能力,结果显示二者之间无相关性[42]。

3.7 聚磷酸盐 (polyphosphates,polyPs) polyPs是阴离子磷酸盐单元的线性聚合物,是可促进VTE形成长链的依赖性机制。在微生物上,polyPs以数十至数千个单位的长链形式存在,可通过因子Ⅻa和激肽释放酶的生成激活接触途径。短链形式的polyPs由致密颗粒中的血小板释放,其功能是加速因子Ⅺ和Ⅴ的活化以此来增强凝血酶的产生。短链polyPs还可抑制TF途径抑制剂并重塑血纤维蛋白凝块,以增加对纤维蛋白溶解的抵抗力。活化的血小板还可以表达与膜相关的polyPs,如球形纳米颗粒,可有效活化Ⅻ因子和接触途径[43]。接触途径是一种蛋白水解途径,包括因子Ⅻ、Ⅺ、前激肽释放酶 (prekallikrein,PK)和高分子量激肽原 (high molecular weight kininogen,HK),当因子Ⅻ与带负电荷的表面 (如polyPs或cfDNA)结合时,可导致PK 裂解为激肽释放酶,从而从HK 产生缓激肽;不依赖因子Ⅻ的接触激活也可以通过内皮细胞上的HK-PK 复合物发生,从而导致PK 激活和裂解,该途径的主要抑制剂是C1 酯酶抑制剂,抑制Ⅻa因子和激肽释放酶[44]。

目前对癌症患者接触途径功能的研究有限,已有研究表明接触途径的激活可导致胃肠道、结肠、直肠和肺癌患者中Ⅻ因子的消耗和减少[45]。

3.8 PAI-1 PAI-1是一种丝氨酸蛋白酶,可抑制组织纤溶酶原激活物和尿激酶。在神经胶质瘤、非小细胞肺癌、多发性骨髓瘤和胰腺癌患者中发现PAI-1 水平升高,对PAI-1处理的人脐静脉内皮细胞进行的体外研究发现细胞EVs释放增加,这与阴离子磷脂表达增加和凝血酶生成有关[46]。贝伐单抗是一种抗血管生成的VEGF抗体,小鼠肺癌模型显示贝伐珠单抗治疗后肿瘤组织和血浆中PAI-1的表达增加,表明在抗血管生成疗法相关VTE 形成中PAI-1可能起更重要的促凝作用[20]。

3.9 血小板活化因子 血小板是血栓形成的关键因素,可与癌细胞分泌物相互作用以增强活化和聚集作用。静止的血小板通过GPⅠb与暴露的vWF 结合后会黏附并在内皮损伤的部位被激活,从而导致细胞内钙离子浓度升高,导致形状改变和二磷酸腺苷 (adenosine diphosphate,ADP)、纤维蛋白原、GPⅠb 和GPⅡb/Ⅲa 的释放;新释放的ADP、血栓烷A2 (thromboxane A2,Tx A2)和CD40 配体 (CD40 ligand,CD40L)驱动进一步的活化。ADP存储在致密颗粒中,释放后结合血小板上的受体P2Y1 和P2Y12进行激活。Tx A2 由血小板活化后的血栓烷合酶合成,并易于扩散穿过质膜,以结合血小板上的Tx A2受体。CD40在活化的血小板上表达,并结合可溶性CD40L,后者在血小板活化后释放。凝血酶 (一种丝氨酸蛋白酶)也可以通过在血小板膜上切割蛋白酶激活的受体1和受体4的胞外域来激活血小板;活化后,血小板通过纤维蛋白原和vWF与GPⅡb/Ⅲa的交联而聚集,形成血栓[47]。

炎症因子对VTE风险预测有一定的临床意义,癌细胞能够分泌血小板活化因子,肿瘤来源的ADP、Tx A2 和CD40L释放,导致肿瘤细胞诱导的血小板聚集、血氧烷合酶过表达,Tx A2 代谢产物增加。此外,在晚期已扩散的癌症患者血浆中发现vWF的大型多聚体,类似结果还见于胶质母细胞瘤、神经胶质瘤以及骨肉瘤细胞系[48]。

3.10 D-二聚体 这是纤溶酶诱导的纤维蛋白溶解的降解产物,并且也是研究癌症患者原发性VTE的最常见生物标志物之一。D-二聚体的治疗前水平升高会增加大肠癌和混合性癌症人群中原发性VTE 的风险[49]。在新诊断或有伴随疾病的癌症患者D-二聚体水平升高与原发性VTE 风险升高呈正相关。肺癌患者化疗前D-二聚体水平升高与VTE风险增加相关,表明D-二聚体水平可能有助于预测模型的危险分级[50]。

在临床,D-二聚体已被纳入Vienna CATS 风险模型中。D-二聚体会随着年龄的增长而增加,并且在炎性环境中D-二聚体可能会升高,导致预测模型中D-二聚体参考标准制定的难度增加[51]。

3.11 P-选择素 P-选择素是在活化的内皮细胞和血小板上的一种细胞黏附分子,可以释放到血浆和EVs。研究表明,可溶性P-选择素水平升高与VTE 风险增加相关,可溶性P-选择素水平≥53.1 ng/L 可使VTE 风险增加2.6倍[52]。

Ottawa评分是复发性VTE 的风险模型,包括性别、原发性肿瘤部位 (肺或乳腺)、分期和既往VTE 的预测指标。此外,有研究表明,抗凝前TF 水平、C 反应蛋白、可溶性P-选择素和D-二聚体水平升高也会增加复发性VTE的风险[53]。

4 治疗方法

低分子量肝素是目前临床推荐的急性血栓预防标准治疗和一线治疗。对于VTE 和癌症,Chest指南和专家小组报告[54]建议使用低分子量肝素代替维生素K 拮抗剂 (2B级),低分子量肝素代替直接作用的口服药物抗凝剂,如达比加群 (2C 级)、利伐沙班 (2C 级)、阿哌沙班 (2C 级)和依多沙班 (2C级)。目前关于使用直接作用的口服抗凝剂治疗与癌症相关的VTE的证据还很少,尽管相对于低分子量肝素而言,直接作用的口服抗凝剂的使用具有实际优势,但仍然缺乏逆转的药物可以快速止血,并且缺乏广泛可用的检测方法来监测其抗凝活性[55]。Hokusai VTE 癌症研究[56]比较达肝素 (低分子量肝素)与edoxaban (一种直接作用因子Ⅹa抑制剂)的安全性和有效性,结果表明在复发性VTE或大出血的综合结果方面,口服edoxaban效果不逊于皮下达肝素;edoxaban的VTE 复发率较低,但严重出血的发生率较高。Hernandez等[57]在癌症并发VTE的患者中比较口服Ⅹa因子抑制剂 (利伐沙班)和低分子量肝素,发现利伐沙班与较低VTE复发率、较高临床相关非重大出血发生率有关。

随着对恶性肿瘤并发VTE的生物标志物内在机制的进一步研究,挖掘出各种潜在的生物标志物,以此来改善风险评估模型和临床决策,有助于提高临床上癌症相关VTE的诊治能力。目前对癌症相关VTE的生物标志物研究仍处于初始阶段,癌症并发VTE的危险因素及内在机制需要进一步研究的证实。此外,尚未见报道评估生物标志物在指导治疗时间和预测抗凝引起的出血并发症中的作用。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突