小干扰RNA技术在逆转肝纤维化中应用效果的研究进展▲

冯一丹 吕蕊花 史琳娜 张喜荣 闫盎然

(陕西中医药大学1 第二临床医学院，2 医学技术学院，咸阳市 712046，电子邮箱：1808827370@qq.com)

【提要】 肝纤维化是多种慢性肝病发展过程中的共同病理改变，发病时肝细胞发生炎症坏死，肝内纤维结缔组织异常增生。目前认为肝纤维化发生的主要机制是肝星状细胞活化、细胞外基质的合成与降解失衡导致细胞外基质在细胞间隙过度积累所致。小干扰RNA技术通过合成反义小分子RNA从而特异性抑制靶基因的转录后表达，在逆转肝纤维化的过程中应用小干扰RNA技术具有强大的潜力。本文从抑制肝星状细胞活化和增殖，促进肝星状细胞衰老、凋亡与死亡，以及直接调节细胞外基质的合成与降解3方面对小干扰RNA技术在逆转肝纤维化中的应用效果进行综述。

肝纤维化是多种病因导致的慢性肝脏疾病发展到肝硬化的中间过程，是一个可逆阶段[1-3]。但目前还未发现可以有效逆转肝纤维化的药物，临床上主要通过去除原发病因或干预纤维化的进程以达到逆转肝纤维化的目的[4]。

RNA干扰技术于1998年首次被发现，是指双链RNA在细胞内特异性诱导与之同源的mRNA降解或抑制其翻译，使相应基因表达关闭，从而诱导基因在转录后水平沉默[5]。之后RNA干扰技术迅速成为研究基因功能的工具之一，另外，该技术作为疾病靶向基因治疗的新手段，已被用于各种疾病的治疗[6]。近年来，有研究发现RNA干扰可以高效、准确地沉默肝纤维化过程中的关键基因，阻止其表达，认为RNA干扰对肝纤维化的逆转有重要作用。本文分别从抑制肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)的活化和增殖，促进HSC的衰老、凋亡与死亡，直接调节细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的合成与降解3方面来对小干扰RNA技术在逆转肝纤维化中应用的相关研究进行综述。

1 小干扰RNA技术抑制HSC的活化与增殖

HSC可分为静止表型和激活表型，正常情况下HSC处于静止状态，当肝脏受到外界刺激时HSC被激活，其表型可由静止型转变为活化型。活化的HSC最显著的特征是表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，分泌多种致炎因子和致纤维化因子，并且实质(如肝细胞)和非实质(如巨噬细胞)细胞均可释放HSC激活因子，使肝肌成纤维样细胞分泌多种ECM，与此同时，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)合成减少，相应的组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)合成增加，从而导致肝纤维化的发生。研究表明小干扰RNA可通过以下5种途径抑制HSC的活化与增殖[7]。

1.1 抑制转化生长因子β1/Smad的表达 转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β1被认为是促纤维化炎症因子中最重要的介导因子，动物实验及细胞实验均显示沉默TGF-β1具有潜在治疗肝纤维化的作用[8-9]。王鲁文等[10]构建TGF-β1 短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)沉默表达载体，并将其注入肝纤维化小鼠体内，结果显示小鼠肝内TGF-β1、Smad3和α-SMA的表达下降，Smad7表达升高，抑制HSC的激活信号，细胞内胶原合成减少，有效抑制了肝纤维化的发展。此外，TGF-β1小干扰RNA还能抑制肝组织中血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)-BB、PDGF-βR及肝组织中磷酸化细胞外调节蛋白激酶(phosphorylated extracellular regulatory protein kinase1/2，p-ERK1/2)的表达，从而起到改善肝纤维化的作用[11]。Fu等[12]将TGF-βRⅡshRNA转入大鼠活化的HSC中，随着TGF-βRⅡ和α-SMA水平的下降，Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白与透明质酸的表达水平也随之降低，肝纤维化程度减轻。

Smads蛋白是TGF-β超家族信号在细胞内转导的一组蛋白，是目前发现的TGF-β受体的唯一底物。Smad通路在调控TGF-β1介导的ECM沉积过程中具有十分重要的作用,没有Smads复合物的参与，TGF-β无法诱导HSC转化、合成并分泌胶原及其他ECM[13]。转染编码Smad7基因的腺病毒至HSC可抑制TGF-β1的生物学活性，从而抑制HSC的活化并阻止肝纤维化的发生[14]。Liu等[15]采用小干扰RNA Smad7转染LX-2细胞，发现其可阻断吡喹酮介导的LX-2细胞活化和TGF-β1介导的Ⅰ型胶原(typeⅠ collagen,Col1)α1的增加，提示Smad7在吡喹酮抗肝纤维化过程中具有的关键作用。除此之外，HSC中内质网应激对肝纤维化进展也具有影响，Koo等[16]研究发现，存在内质网应激的患者或小鼠的肝组织中Smad2表达水平增加，经慢病毒载体将Smad2小干扰RNA转入肝组织后，内质网应激介导HSC激活的作用减弱，这表明HSC中的内质网应激促进了肝纤维化的发生，且该过程是通过诱导Smad2的过度表达来实现的，而采用小干扰RNA技术干扰Smad2表达可以抑制HSC激活从而缓解肝纤维化。

1.2 抑制高迁移率族蛋白B1的表达 高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)是非组蛋白核内结构蛋白，主要由坏死细胞被动释放以及单核/巨噬细胞受脂多糖等刺激后表达[17]。研究发现，HMGB1不仅在细胞核内发挥作用，而且被释放到胞外时可作为一种有效的炎症介质诱发严重的炎症反应[18]。目前研究认为，HMGB1有可能成为抗炎和防止组织损伤的重要靶点[19]。葛文松等[20]将HMGB1小干扰RNA用Lipofectamine包裹转染至HSC-T6细胞后发现，细胞增殖受到抑制，凋亡加速，Col1、Ⅲ型胶原(typeⅢ collagen,Col3)表达水平也显著降低。另有研究发现，HMGB1小干扰RNA可显著抑制肝内胆管细胞癌的迁移及侵袭，并降低MMP-14蛋白的表达，这提示HMGB1小干扰RNA可以抑制肝内胆管细胞癌增殖，减少胶原沉积，具有预防及治疗肝纤维化的潜力[21]。此外，Lan等[22]将HMGB1小干扰RNA导入到小鼠肝细胞系AML-12中，发现其可减少AML-12细胞HMGB1的释放以及炎症细胞因子的产生，减轻酒精诱导的肝损伤，阻断其进一步发展为脂肪性肝炎、纤维化、肝硬化甚至肝癌。

1.3 抑制结缔组织生长因子、血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子的表达 结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)在伤口愈合过程中呈过表达，诱导肌成纤维细胞增殖，导致胶原积累，进而加重肝纤维化[23]。Yu等[24]设计PEI-Fe3O4NP将CTGF小干扰RNA转入HSC后发现，CTGF小干扰RNA可以降低活化HSC中CTGF的表达水平和胶原蛋白的产生。另有学者用CTGFshRNA转染HSC-T6细胞，发现HSC-T6细胞生长明显受到抑制，生长繁殖被阻滞于S期，TGF-β1、Smad3 mRNA及蛋白的表达量下降，Smad7 mRNA及蛋白的表达水平升高，提示CTGF小干扰RNA在逆转肝纤维化进程中有重要作用[25]。血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)在肝损伤时呈过表达，因此被认为是激活HSC的有效因子，可以显著促进HSC的增殖[4]。用小干扰RNA沉默PDGF受体β，发现PDGF受体β小干扰RNA能明显抑制PDGF-BB的促HSC-T6细胞增殖效应，降低CTGF、TIMP-1和Col1 mRNA表达水平[26]。此外，作为血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族一员的胎盘生长因子(placental growth factor，PlGF)也能介导伤口愈合和炎症反应，在肝纤维化的发展和血管的生成中发挥重要作用。Li等[27]构建PlGF小干扰RNA载体并经尾静脉注入胆管结扎的小鼠体内，发现沉默PlGF可以降低小鼠肝脏的炎症和纤维化程度，抑制HSC的激活与巨噬细胞的活化，并大幅降低了肝纤维化中促炎因子和趋化因子的表达水平，减轻肝纤维化程度。

1.4 抑制血管紧张素Ⅱ的表达 血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)通过诱导NADPH氧化酶(NADPH oxidase，NOX)依赖性氧化应激来加重肝纤维化。AngⅡ的七肽片段Ang-(1-7)可降低AngⅡ的水平，从而预防肝纤维化。Zhang等[28]给予AngⅡ 刺激肝细胞之前采用NOX4小干扰RNA预处理细胞，发现AngⅡ诱导的肝细胞上皮-间质转化被抑制。另有学者研究发现NOX4小干扰RNA可抑制AngⅡ诱导的NLRP3炎症小体激活和胶原蛋白合成[29]。Alamandine是新发现的肾素-血管紧张素系统的组成成分，有研究发现，其可通过MrgD受体对AngⅡ 发挥负调控作用，研究人员针对MrgD受体设计了MrgD受体小干扰RNA并将其转入HSC中，发现Alamandine以及MrgD受体激动剂β-alanine都不能抑制AngⅡ的诱导作用，提示Alamandine是通过MrgD受体抑制NOX4介导的活性氧生成来调控HSC自噬，阻断Ang诱导肝纤维化作用[30]。

1.5 抑制瘦素的表达 瘦素是由ob基因编码的分泌型蛋白质，主要由贮脂细胞产生。研究表明，活化的HSC中瘦素 mRNA和蛋白质合成均增加。薛秀兰等[31-32]设计瘦素小干扰RNA并将其转入HSC中，同时将其转染后的HSC导入肝纤维化大鼠体内，结果发现瘦素小干扰RNA可以有效地抑制HSC细胞增殖，促进HSC细胞凋亡，显著抑制Col1和信号转导与转录激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)的表达。此外，还有研究发现，转染瘦素shRNA的肝纤维化组织中，Col1及Col3的沉积程度均明显下降，从而减缓了肝纤维化的发展程度[33]。

2 小干扰RNA技术促进HSC的衰老、凋亡与死亡

各种不良刺激可以激活处于静止状态的HSC，使其转化为肝肌成纤维样细胞，不断生成ECM，导致肝纤维化。因此，促进HSC的衰老、凋亡与死亡是减轻肝纤维化的有效途径。

2.1 抑制半乳糖凝集素3的表达 半乳糖凝集素3(galectin 3,Gal-3)存在于多种组织和细胞内,参与细胞黏附、增殖、凋亡、炎症反应和免疫反应等多种病理生理过程，还参与肾、肺等纤维化形成过程[34]。Henderson等[35]研究发现，沉默Gal-3基因后，肌成纤维细胞活化和Col1的表达被阻断，肝纤维化程度明显减轻。有学者构建Gal-3小干扰RNA并将其转染至大鼠肝星状细胞系rHSC-99细胞，也发现细胞增殖明显受抑制，细胞凋亡率增高，细胞死亡率增加了1.7～2.2倍[36-37]。

2.2 抑制B淋巴细胞瘤-2家族的表达 B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)基因作为一种抗凋亡蛋白基因，可保护细胞免于病毒、氧化剂等刺激而引起的凋亡。研究发现，在人肝纤维化过程中Bcl-2过表达,可导致HSC持续活化，从而使慢性肝病迁延难愈[38]。Tian等[39]采用肝靶向纳米颗粒将阿霉素(DOX)和Bcl-2小干扰RNA转入HepG2细胞内，结果显示，该干预可以诱导更多的HepG2细胞凋亡。另有学者构建pGPU6-GFP-shRNA并将其转染至HSC-T6细胞，发现HSC-T6的Bcl-2基因表达抑制率达80%，HSC-T6细胞生长明显受抑，这表明沉默Bcl-2能有效抑制HSC中Bcl-2的表达及HSC-T6细胞生长,促进HSC-T6细胞凋亡[40]。

2.3 抑制核因子κB家族的表达 核因子κB(nuclear factor kappaB，NF-κB)参与细胞对外部刺激的反应,由p50和p65组成的异源二聚体是NF-κB家族成员最常见的形式。NF-κB的激活在细胞黏附、生长和分化中起关键作用，且活化的NF-κB信号通路通过上调其下游的靶基因如环氧合酶2(cyclooxygenase 2，COX2)、细胞周期蛋白D1(cyclinD1)、Bcl-2等,抑制细胞凋亡。Cui等[41]采用NF-κBp65小干扰RNA转染HSC-T6细胞72 h后，再用脂多糖刺激细胞1h，结果发现NF-κBp65小干扰RNA可有效降低HSC-T6细胞中Bcl-2、Col1、α-SMA、TGFβ1、抗凋亡蛋白A1和基质金属蛋白酶抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP-1)的mRNA表达水平，MMP-2活性增高，促进HSC凋亡。有学者发现，增高半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,Caspase3)活性可明显促进HSC凋亡，这表明p65小干扰RNA可以特异性地阻断NF-κB基因表达，促进HSC的凋亡[42]。此外，张彦亮等[43]发现核因子κB激酶抑制剂(inhibitor of nuclear factor kappaB kinase，IKKβ)小干扰RNA可使HSC的凋亡率显著增加，Caspase3和Bcl-2相关x蛋白表达水平均明显升高，而NF-κBp65和Bcl-2蛋白的表达水平明显下降，HSC凋亡增加，肝纤维化被抑制。

另外，NF-κB还可以直接促进HSC的衰老和死亡。贾岩[44]研究发现，莪术醇诱导的程序性坏死信号可以竞争性抑制促细胞生长的NF-κB的mRNA和蛋白表达，进一步抑制骨膜蛋白介导的活化型HSC的迁移、黏附,进而发挥抗肝纤维化作用。有学者发现经尾静脉将COX2 shRNA慢病毒载体注入肝纤维化大鼠体内后，肝纤维化组织细胞衰老指数明显增加，α-SMA mRNA、COX-2 mRNA表达水平显著下调，p53 mRNA表达水平显著上调，表明COX2 shRNA可促进肝纤维化组织细胞衰老[45]。

3 小干扰RNA技术直接调节ECM的合成与降解

多种病因可导致肝脏炎症，使ECM沉积导致肝纤维化，而在这个过程中，这些病因可能均通过诱导相似的下游通路导致肝纤维化的发生，因此，调控这个相似的下游通路或许可以阻断ECM沉积，从而实现抗纤维化治疗[46]。研究发现，核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族端酶募集结构域5(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family caspase recruitment domain containing 5,NLRC5)在肝纤维化中的过表达导致HSC中Col1和α-SMA的表达水平上调，而NLRC5小干扰RNA可降低Col1和α-SMA的表达水平[47]。另有学者发现阻断NLRC5表达可降低α-SMA、Col1α1 mRNA及蛋白的表达水平，表明NLRC5可以通过干预HSC活化和ECM合成来调节或抑制与肝纤维化相关的关键基因[48]。

3.1 调节纤溶酶原激活物抑制剂1/尿激酶型纤溶酶原激活剂的平衡 由尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase-type plasminogen activator，uPA)、纤溶酶、纤溶酶原激活物抑制剂1(plasminogen activator inhibitor type 1，PAI-1)和MMP构成的反应体系是调节ECM降解的主要途径，在肝纤维化形成和发展中起重要作用[49]。纤溶酶原激活物/纤溶酶系统位于纤维溶解系统的上游，能够直接降解基质成分，并通过激活MMP间接抑制ECM的沉积[49]。越来越多的研究表明纤溶酶原激活物/纤溶酶系统在调节ECM降解和沉积之间的平衡中发挥关键作用[49-51]。Hu等[49]研究发现，下调PAI-1表达水平后肝纤维化得到明显改善，原因可能是下调PAI-1表达水平后，MMP-9及MMP-13表达水平上调，TIMP-1的表达水平下调，从而促进ECM降解。还有学者将重组腺病毒质粒pAdshPAI感染HSC-T6细胞后发现，Col1、Col3、α-SMA、TGF-β1和TIMP-1 mRNA表达水平明显降低，MMP-9和MMP-13 mRNA表达水平明显上调，肝细胞增殖加快，凋亡减少，HSC增殖减慢，G0/G1期时相HSC-T6细胞数目明显增高，S期细胞数百分比明显降低，提示沉默PAI-1可诱导HSC-T6细胞周期静止，抑制其增殖，减缓肝纤维化进程[51]。

3.2 调节基质金属蛋白酶/基质金属蛋白酶抑制剂的平衡 肝纤维化的特征是ECM过度积累，主要病因是ECM生成的增加和ECM降解的减少。ECM降解减少是由于MMP和TIMP之间的不平衡，MMP几乎能降解ECM中的各种蛋白成分，从而调节ECM降解过程。肝损伤后，TIMP-1过表达导致ECM降解减少[4]。Li等[52]研究发现，沉默MMP-2可导致HSC存活率降低，纤维形成标志物减少。TIMP-1在活化的HSC中呈高表达，并通过抑制基质降解和细胞凋亡促进肝纤维化，采用小干扰RNA沉默TIMP-1后可以减少HSC的增殖和纤维形成[52]。另有学者靶向沉默大鼠体内TIMP-1和TIMP-2的表达后发现，其上游细胞因子PDGF及其受体的表达下调，进而导致p-ERK1/2蛋白的表达水平降低，最终抑制HSCs活化增殖、减轻肝纤维化[53]。

4 小干扰RNA技术调控其他作用因子

核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)是调节机体氧化还原反应的重要转录因子，能调节多种抗氧化基因的表达，研究发现，Nrf2信号通路通过调控肝脏的氧化损伤在肝纤维化的防治中发挥重要作用[54]。Prestigiacomo等[55]采用小干扰RNA技术敲除HSC细胞的Nrf2后发现，HSC被激活，HSC迁移及增殖增加，α-SMA和ECM表达水平升高。另有学者发现Nrf2小干扰RNA可使TGF-β1诱导的活性氧物质增多，促进PAI-1表达水平及Smad3的磷酸化水平增高，促进肝纤维化，提示Nrf2在肝纤维化形成与发展过程中有重要作用[56]。

自噬可以促进HSC活化，肿瘤相关基因H19参与了自噬的调控,其过表达可促进HSC的活化，而长链非编码RNA(long noncoding RNA,LncRNA)-H19已经被证实是调控肝纤维化发生发展的重要分子[57]。有研究显示，胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(insulin-like growth factor binding protein-related protein 1，IGFBPrP1)是一种新发现的致肝纤维化因子，将小干扰RNA-H19转入IGFBPrP1过表达的小鼠的肝星状细胞株16 h后，IGFBPrP1 mRNA、LC3B mRNA、α-SMA mRNA的表达水平受到抑制，肝纤维化减轻[58]。此外，HSC的活化往往伴随着脂滴的消失，LncRNA-H19与脂肪酸、胆汁酸和葡萄糖等多种代谢方式有关，将小干扰RNA LncRNA-H19转入HSC后，HSC的活化被抑制，HSC中的脂滴含量增加，这提示降低LncRNA-H19的水平，可以恢复HSC脂滴含量,抑制HSC活化,改善肝纤维化[57]。

近年来，很多学者应用小干扰RNA技术减轻肝纤维化程度，如设计了人骨形成蛋白9小干扰RNA、生长因子受体结合蛋白2小干扰RNA、上皮细胞黏附分子小干扰RNA、成纤维细胞生长因子受体小干扰RNA、肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子2小干扰RNA，在动物实验中均发现上述小干扰RNA技术具有很好地减轻肝纤维化的效果[59-63]。

5 小 结

肝纤维化是多种病因导致的肝损伤之后的修复代偿过程，是疾病进展到肝硬化甚至肝癌的可逆阶段。应用小干扰RNA技术沉默肝纤维化过程中的关键基因，可以抑制HSC活化及增殖，促进HSC凋亡，减少ECM沉积，从而逆转肝纤维化。但现阶段小干扰RNA技术的应用大多限于细胞与动物实验，尚未进行临床试验，其在临床上的应用效果如何还有待进一步深入研究。