自噬与糖代谢重编程在膀胱癌恶性进展中调控作用的研究进展

李庭浩 童行 何卫阳

膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤，其在全球的癌症发病率中排名第十，也是我国泌尿外科最常见的恶性肿瘤之一[1-3]。依据其病理进展分为肌层浸润性膀胱癌(muscle invasive bladder cancer, MIBC)和非肌层浸润性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer, NMIBC)。研究表明应用新辅助化疗(neoadjuvant chemotherapy, NAC)对MIBC患者进行联合治疗能够一定程度实现肿瘤降级或改善预后[4-6]，但由于治疗费用较高、患者耐受性差及应答率低等原因，在实际应用中存在着一定的局限性[7]。因此探寻MIBC进展机制，延缓或减少其转移复发，从而提高患者术后生存质量显得十分重要。自噬及糖代谢重编程在膀胱癌发生、发展过程中起着重要的作用，膀胱癌作为实体瘤的一种，其癌细胞处于癌组织、正常组织及细胞间质、微血管等形成的肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)中，多处于炎症、缺氧或饥饿状态，并且在放化疗等进一步刺激下，内环境的变化可能导致癌细胞代谢压力增大，此时癌细胞可能通过自噬协助应对[8]，同时癌细胞因此发生细胞形态、细胞代谢状态和生物行为的改变，部分细胞甚至转变为增殖能力增强、侵袭转移能力增加、耐药能力上升和肿瘤免疫逃避等肿瘤进展性变化[9-10]。癌细胞特征性改变之一是糖代谢的重编程，这可能也是由于TME刺激引起，在营养缺乏的情况下通过改变糖代谢方式并减少耗氧量使细胞向着更利于生存的方向转变，进而促进癌症的进展性发展[11]。诸多研究发现自噬或糖代谢重编程在膀胱癌恶性进展中扮演着十分重要的角色，但多作为独立影响因素来进行探究，而在其他实体瘤诸如肝癌、胶质瘤中发现二者可能存在着相互影响，共同发挥影响肿瘤进展的作用，但目前在膀胱癌中报道尚少。故本文拟对近期膀胱癌关于自噬和糖代谢两方面的研究进展进行综述，并总结二者在已有研究中存在的关系和对肿瘤的影响，尝试从新的角度阐述影响膀胱癌发生、发展的机制，为治疗MIBC提供可能的研究方向。

一、糖代谢重编程在膀胱癌中的研究进展

1.糖代谢重编程与癌症：癌症的一种重要特征是能量代谢的改变，以利于其增殖及侵袭转移等能力的形成[12]。葡萄糖作为细胞主要的供能物质，正常状态下会被细胞摄取后通过有氧代谢途径最终在线粒体产生大量的三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)用于供能，然而实体瘤细胞因其不仅有快速增殖的特性，而且往往处于低氧、饥饿等TME中，使其需要一种能够更快速的代谢糖以产生所需的能量和原料的方式，即糖的有氧糖酵解[13-14]。肿瘤细胞内糖的有氧糖酵解转变最早是由Warburg提出的[15]，也称为瓦伯格效应，指癌细胞即使是在氧气充足的状态下依旧通过高速糖酵解快速产生ATP，并且不再偶联线粒体氧化代谢，产生的丙酮酸大多数由乳酸脱氢酶催化而在细胞质基质中转化为乳酸[16]。起初Warburg认为有氧糖酵解的出现是因为线粒体受损，但后来的研究发现在线粒体完好的情况下癌细胞依然表现出瓦伯格效应，而糖代谢的重编程与线粒体DNA、致癌基因和肿瘤抑制因子等的改变密切相关[17]，因此有理由怀疑肿瘤细胞的糖代谢重编程可能参与了肿瘤发生和发展的过程。近年来不断有研究者发现膀胱癌患者的癌细胞中存在着异常的糖代谢重编程，其代谢方式的改变可能在膀胱癌进展性生长中起到了关键的作用。

2.糖代谢重编程参与膀胱癌耐药形成：膀胱癌的癌细胞糖酵解异常增加主要归因于糖酵解相关基因的过表达以及糖酵解关键酶的产生或功能异常[18]，这可能促进了癌细胞耐药性的增强。丙酮酸脱氢酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinase, PDK)家族可调控丙酮酸脱氢酶活性，其可通过将丙酮酸的代谢从线粒体内转移至胞浆中，促进有氧糖酵解的形成。在其它肿瘤中已有研究证实抑制PDK能有效逆转肿瘤细胞对化疗药物的耐药[19]，Woolbright等[20]研究发现高度恶性的膀胱癌细胞PDK4表达明显增高，利用PDK4竞争性抑制剂DCA以及siRNA敲低相关基因表达后，肿瘤细胞会在G0～G1期被抑制生长，同时联合膀胱癌化疗药物顺铂可有效的增加药物对肿瘤细胞的杀伤能力。该文作者认为PDK4是通过增强有氧糖酵解，使ATP快速生成能力提高以及对顺铂作用的线粒体去极化诱导凋亡的抵抗，进而产生对化疗药物的耐药能力形成[21]。另外M型丙酮酸激酶(pyruvate kinase M, PKM)作为丙酮酸激酶的一种亚型，调节磷酸烯醇丙酮酸向丙酮酸的转化，也是糖酵解的限速酶之一[21]。Wang等[22]发现相较于正常膀胱组织，无论是低级别的NMIBC还是高级别的MIBC，PKM2亚型的表达均远高于PKM1，而降低其异常表达可有效阻遏癌细胞的增殖以及耐药能力，增加顺铂对肿瘤细胞的杀伤作用；并且在对三株膀胱癌细胞进行耐药诱导的实验中发现,随着顺铂浓度不断增加，细胞的耐药能力与检测到的PKM2表达量呈正相关。尽管越来越多的证据显示瓦伯格效应与膀胱癌的耐药能力形成有关，但具体机制仍不清楚，可能与葡萄糖的摄入增加和代谢异常相关，也可能是影响了肿瘤细胞其他代谢方式包括脂代谢以及氨基酸合成等，而无论是膀胱癌还是其他癌症中均有实验均已证实抑制癌细胞糖代谢的重编程可以有效地逆转癌症的耐药，增加药物对肿瘤的杀伤作用[23-24]。就目前的研究表明，膀胱癌细胞通过改变其糖酵解关键酶的表达水平，利用线粒体代谢改变等方式影响其程序性凋亡，进而产生耐药性是较为主流的研究方向，然而关键酶表达或转录后修饰的原因，可能是通过转录因子或修饰酶的增减，抑或是DNA本身的变化导致，都值得进一步研究。

3.糖代谢重编程与膀胱癌恶性程度的相关性：恶性程度较高的癌细胞株也显示了更高的糖酵解转变。研究发现在乳腺癌中，尽管在氧气充足的环境下体外培养，非侵袭性的乳腺癌细胞株相比侵袭性的株系糖消耗量更少,这说明恶性程度更高的肿瘤细胞糖酵解的代谢转变可能更多[13]，类似的实验在膀胱癌中同样被证实并得到了进一步的探究。Conde等[25]分别对MIBC细胞株TCCSUP和NMIBC细胞株RT4进行了代谢摄取与消耗，在相关蛋白表达量的对比中发现，尽管葡萄糖转运蛋白3(GLUT3)和糖消耗量在两个细胞株系中无明显差别，相对恶性程度更高的TCCSUP细胞GLUT1和PFK蛋白的表达有着明显的上升，而且丙酮酸的消耗量及乳酸与丙氨酸的生成量也要高于RT4细胞。而这些变化是如何产生的，以及其对膀胱癌细胞侵袭和转移的影响是如何作用的，可能还需要进一步的探究。

综上，尽管瓦伯格效应对癌症的影响距离被提出已经将近百年，对它的研究也从未停止，然而线粒体功能的下降或抑制与糖酵解的代谢重编程过程的机制始终未得到充分的认识。随着葡萄糖类似物示踪技术即氟脱氧葡萄糖-正电子体层扫描的应用，且在应用中进一步证实了在恶性程度越高的肿瘤患者中，原发灶和转移灶都显示了更高的葡萄糖摄取率，对糖代谢重编程在癌症中的探索仍然具有重要的意义。膀胱癌细胞特别是在恶性程度较高的癌细胞中有氧糖酵解程度更高，提示其可能影响了膀胱癌在侵袭、增殖或耐药能力形成等进展性变化过程，对其代谢转变的上游机制进行探究并进行阻断，能够在一定程度上阻遏其恶行进展过程，为膀胱癌甚至泛癌治疗提供新手段。

二、自噬在膀胱癌中的研究进展

1.自噬与癌症：自噬是真核细胞进化出的一种保守的生理分解代谢过程，于1966年首次由De Duve等[26]提出，在体细胞中以基础水平保持[3]。细胞自噬可按照物质运送至溶酶体方式的不同分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬，其中巨自噬作为研究的热点[27]，其作用相对更加重要，本文主要以巨自噬作为自噬的主要形式进行讨论。自噬在癌细胞的发生、发展中扮演着双刃剑的角色，当处于应激状态下如缺氧、饥饿、照射或化疗时，细胞可通过上调细胞自噬水平，将老化的细胞器或蛋白进行包裹形成自噬小泡，再同溶酶体相结合形成自噬-溶酶体复合物并进一步进行降解，从而阻止损伤的蛋白和细胞器的积累，以保持内环境的稳态，起到抗肿瘤的作用；但同时分解的产物同样可暂时的供应细胞能量，帮助应对刺激维持细胞的生存[28-29]。自从自噬这种生物学过程被提出以来，越来越多的实验证实了自噬在膀胱癌晚期的进展中可能起到了促进的作用，在膀胱癌侵袭能力的增加和耐药的形成过程中可能引起了关键的变化。

2.自噬相关基因(autophagy related gene, ATG)与膀胱癌恶性进展：ATG的上调可能是膀胱癌进展性变化的重要一环。ATG家族编码的一系列蛋白参与了自噬相关的诸多过程，其中ATG7作为必需的自噬基因，编码泛素样蛋白LC3家族脂化和自噬小体形成所需的E1酶，在诸多研究中得以探究[30]。Zhu等[31]对包括侵袭性膀胱癌细胞、临床膀胱癌组织及裸鼠异体肿瘤组织与正常尿路上皮细胞进行对比后发现，ATG7的异常高表达与肿瘤侵袭能力增加显著相关，并进一步对其机制进行探索。他们对ATG7 mRNA的3’端可结合miRNA进行筛选后发现，miR190A可通过直接结合ATG7 mRNA的3′端非编码区来增加ATG7 mRNA的稳定性，进而引起ATG7的蛋白表达量上升和自噬水平的增强。进一步探究后发现ATG7可能通过提高自噬水平进而提高膀胱癌侵袭的能力，其机制是ATG7过表达使HNRNPD蛋白在膀胱癌细胞中自噬消化增多，RNA结合蛋白免疫实验证实了HNRNPD蛋白可结合ARHGDIA mRNA使其翻译受损，HNRNPD蛋白的降解增多使ARHGDIA mRNA稳定性得到了增加，从而使ATG7下游的ARHGDIA过表达，引起膀胱癌细胞的侵袭性增加。这篇报道结合体内和体外实验证实了MIBC侵袭能力的增加是ATG7提高细胞自噬水平引起的下游事件，证明了自噬促进了膀胱癌的进展。Wu等[32]通过对膀胱癌患者癌及癌旁组织对比发现了长链非编码RNA尿路上皮癌胚抗原1(lncRNA UCA1)的高表达，lncRNA UCA1可通过结合miR-582-5p来阻止其与ATG7的结合，使ATG7表达量升高、自噬水平上调，而通过shRNA敲低lncRNA UCA1可有效的抑制膀胱癌细胞的自噬，从而抑制癌细胞的增殖、侵袭及耐药能力。不仅ATG7，ATG家族其他成员与膀胱癌的恶性进展均有着密不可分的影响关系，大多数研究表明自噬相关基因与其他调控因子的协同改变可能促进癌细胞的进展，相关蛋白的调控如lncRNA或microRNA作为ceRNA影响蛋白的功能或蛋白修饰的改变，可能在癌症进展中起到了重要的作用。

3.自噬与膀胱癌耐药形成：自噬可作为癌细胞一种保护性的反应，在应对药物时通过上调自噬来抵抗药物引起的凋亡以逃避杀伤作用，诱导癌细胞获得性耐药。研究表明MIBC患者特别是T2级别及以上患者接受NAC可有效使肿瘤降级，利于患者的手术及预后[33]，NAC的常用方案是基于铂类药物为主，如最早的MAVC(甲氨喋呤+长春新碱+阿霉素+顺铂)方案，目前较多使用的GC(吉西他滨+顺铂)方案以及针对药物不耐受所提出的以卡铂替代顺铂的GCarbo方案[34]。然而仍有一相当部分患者对化疗药物产生耐药性，这不仅使患者无法从中获益，延迟治疗时机，还给患者带来药物不良反应的伤害[34]。化疗耐药机制复杂，自噬可能参与其形成过程。Lin等[35]对高级别膀胱癌细胞对顺铂的药物敏感性进行了探究，发现顺铂会引起膀胱癌细胞BECN1基因的过表达，通过影响ATG7/12进而引起自噬的水平升高，自噬在一定程度上减轻或阻止顺铂诱导的膀胱癌细胞凋亡。而应用自噬抑制剂氯喹或Baf A1以及应用shRNA敲低BECN1阻断自噬后细胞凋亡增加，提示了自噬可能参与顺铂的耐药形成过程。Jiménez-Guerrero等[36]就抗血管生成药物紫杉醇在尿路上皮癌耐药的探究中发现，Mcl-1抑制剂与紫杉醇联用后可诱导原本对紫杉醇耐药的膀胱癌细胞发生凋亡，其机制可能是抑制剂通过增加Beclin1的分解抑制耐药细胞的自噬，以及抑制Mcl-1使其泛素化从而阻滞S/G2期的细胞逃避有丝分裂滑脱，帮助克服耐药细胞对紫杉醇的抵抗。

综上，在膀胱癌的晚期进展过程中尤其是在其转移以及耐药的形成上，自噬可能作为一种细胞反应性的机制，通过不同的信号途径在细胞周期调控或代谢调节的过程中影响癌细胞的进展。而在针对线粒体的化疗过程中，异常的自噬水平可能作为一种代谢的适应性改变，从而导致癌细胞产生耐药性，促进了膀胱癌的恶性转化[37-38]。

三、自噬调控糖酵解在癌症进展中发挥的作用

1.自噬调控代谢重编程在癌症进展中的作用：在癌症进展的过程中，异常的增殖能力与TME营养物质缺乏、恶劣微环境似乎是矛盾的，但二者确实同时存在。其可能的解释是通过增加代谢产物的重利用，以及通过降解与生长无关的物质或受损细胞器，并改变细胞的代谢方式和结构，最大限度地供给癌细胞的生长与进展的相关物质合成[39]。理论上代谢重编程与自噬可以相互作用以供给细胞所需的大多数营养物质，自噬在癌细胞的代谢重塑中扮演着重要的角色，相关联的核心为三羧酸循环。诸多实验对癌细胞代谢重编程进行探究，包括糖代谢、脂代谢以及氨基酸代谢等，均发现与癌症的进展有密切的关系，而自噬在其中起到关键的作用[40-41]。Strochecker等[42]研究发现敲低自噬相关基因ATG7可通过阻断自噬影响肺癌细胞的氧消耗率及癌细胞生长，而在敲低的细胞中加入外源性谷氨酰胺能够使细胞的增殖能力得以恢复，故认为肺癌细胞通过自噬影响谷氨酰胺代谢的重编程，进而影响癌细胞的进展性生长。Ma等[43]在胆管癌细胞中发现异常高表达的lncRNA HAGLROS与癌症的生长及恶性进展呈明显相关性，敲除lncRNA HAGLROS后，可抑制mTOR通路促进自噬进而改善癌细胞脂质代谢重编程，从而阻断癌细胞的恶性进程。因此自噬在调节癌细胞代谢重编程过程中可能扮演着上游开关的角色，进而影响着癌细胞生物学行为的改变。

2.自噬调控糖代谢重编程在膀胱癌及其他癌症中的研究：癌细胞特征性表现之一为葡萄糖代谢由氧化磷酸化向糖酵解转变，这一现象也被称为瓦伯格效应，自噬在其中的影响以及对癌细胞恶性进展等方面有着较为成熟的研究。TME在其中扮演着多重角色，当细胞处于营养充足的环境中时，雷帕霉素复合物1(MTORC1)可促进细胞生长，并通过抑制ULK1抑制自噬，而当细胞供能不足时AMPK将被活化，并通过抑制MTORC1而激活ULK1调控自噬的发生，提示细胞的糖代谢与自噬有着相互影响的作用[44]。另有研究发现膀胱癌细胞中miRNA-21可以经PTEN/PI3K/AKT/mTOR信号通路提高癌细胞有氧糖酵解，针对该靶点的慢病毒可有效阻遏该效应[45]。lncRNA UCA1是膀胱癌中最早发现过表达的lncRNA之一[46]，Li等[47]发现lncRNA UCA1能够上调糖酵解关键酶己糖激酶2(hexokinase, HK2)活性从而引发细胞的瓦伯格效应，其具体机制为lncRNA UCA1通过mTOR活化了STAT3并抑制miRNA-143。尽管在膀胱癌中研究较少，但HK2的活性调节在肝癌中起到了自噬调控糖酵解的开关作用，在肝癌细胞中由泛素连接酶TRAF6催化Lys63使HK2泛素化，自噬可以依靠SQSTM1/p62受体识别并选择性降解泛素化HK2，从而抑制肝癌细胞有氧糖酵解和肝癌细胞增殖[48]。此外，单羧酸转运蛋白作为转运乳酸以及清除氢离子的重要蛋白，在调控癌症代谢与自噬间同样起着重要的作用[49]。在膀胱癌患者中MCT1过表达与患者癌症进展及预后显著相关，敲低后可明显降低糖酵解途径关键酶活性、减少乳酸生成并延缓膀胱癌细胞增殖、侵袭、转移及上皮间质转化等恶性进展，证实膀胱癌细胞的瓦伯格效应变化与恶性进展呈正相关[50]。饥饿诱导肝癌细胞自噬水平的增强，可通过Wnt/β-catenin信号通路正向调节MCT1的过表达，促进癌细胞有氧糖酵解的发生以及侵袭能力增强[51]。此外在急性髓系白血病中敲低lncRNA HOTAIRM1也可通过Wnt/β-catenin途径有效地抑制P型磷酸果糖激酶(PFKP)的活性，抑制癌细胞的糖酵解并逆转其介导对阿糖胞苷的耐药作用，而沉默PFKP能够有效抑制饥饿诱导的自噬水平上调所引起的癌细胞有氧糖酵解增加以及上皮间质化转变[52-53]。由此可见自噬的异常激活可能从正反两个方向调控着糖代谢的重编程，进而扮演着抑癌或促癌的双重角色，两者错综复杂的调控关系改变可能与其上游启动的不同机制密切相关，不同激活途径诱导的不同结局对癌症进展的认识和治疗有着重大的意义。

在实体瘤所处的TME中，正常代谢受到限制的肿瘤细胞可以依靠自噬生存，并重新编程其代谢以适应细胞的快速生长和增殖[8]。尽管目前对于不同信号通路在癌细胞自噬与糖酵解重编程之间所起到的桥梁连接作用已有较多研究成果，且逐渐认识到癌细胞的自噬及代谢重编程等变化与癌症进展性生长以及侵袭转移、耐药形成甚至是免疫逃避等有着密不可分的关系，但其机制更多倾向于自噬相关基因与糖酵解关键酶所受的相互调控，其中复杂的启动及调控网络都值得探索。目前对于自噬及瓦伯格效应在膀胱癌中的相互作用关系尚未见报道，对其更加深入的研究可能从新的视角更好认识这一疾病，为探索膀胱癌发展机制以及延缓其进展的治疗策略奠定基础。

近年来，针对探索膀胱癌特别是高级别恶性膀胱癌行之有效的治疗手段一直是研究探索的热点，放疗、NAC以及免疫治疗等研究均获得了一定的成效，尤其是针对转移性膀胱癌的免疫检查点PD-1和PD-L1的单克隆免疫抗体阻断治疗取得了较好疗效[54-55]。膀胱癌细胞异常上调的自噬以及有氧糖酵解的代谢重编程均被发现与癌症的恶性进展密切相关，自噬对糖酵解以及关键酶转录或表达层面的影响均被证实为可能是影响癌症发生、发展的重要环节，对二者的联合抑制也可能成为新的更安全有效的治疗策略，而二者由何启动及调控，与其对膀胱癌进展影响的作用也值得进一步的探究。